關(guān)于細(xì)菌超聲破碎的一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式，一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的高效表達(dá)，由于蛋白的過(guò)度表達(dá)，使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無(wú)規(guī)則卷曲，以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中，這就是所說(shuō)的包涵體，另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá)，即可以發(fā)生正常折疊，具有生物活性。一般情況下，細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過(guò)離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開。

超聲破碎的條件一般是300w，10s/10s，20分鐘，具體條件可根據(jù)自身情況而定。

超聲前菌體的準(zhǔn)備：菌液離心后，先用PBS將菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體，裂解液的成分：50mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA，100mMNaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%TritonX-100。切記冰浴超聲！

如何判斷是否超聲完全：根據(jù)網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn)，一般有以下幾個(gè)方面：1，外觀判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。2，液體的粘滯性：超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

3，高速離心：有用高速離心檢測(cè)超聲破碎程度的（一般用6,000g10min,比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點(diǎn)）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。4，染色：破碎后的菌液涂片，革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘，鏡檢。超聲后加入核酸酶消除核酸對(duì)蛋白的污染。一些需要注意的問(wèn)題：

1，蛋白以包涵體形式表達(dá)，追求的是高破碎率，要求細(xì)胞碎片很小，而另一種蛋白是可溶形式表達(dá)，所以細(xì)胞碎片不能很小，兩種情況要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分離。2，如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說(shuō)明超聲功率太強(qiáng)。3，超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。4，盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

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細(xì)菌工程菌胞內(nèi)表達(dá)主要分為兩種形式，一種是在強(qiáng)啟動(dòng)子條件下的高效表達(dá)，由于蛋白的過(guò)度表達(dá)，使蛋白不能及時(shí)有效折疊而發(fā)生無(wú)規(guī)則卷曲，以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中，這就是所說(shuō)的包涵體，另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達(dá)，即可以發(fā)生正常折疊，具有生物活性。一般情況下，細(xì)菌只要被正常破壁就可以通過(guò)離心的形式將包涵體和可溶性表達(dá)的蛋白分離開。

超聲破碎的條件一般是300w，10s/10s，20分鐘，具體條件可根據(jù)自身情況而定。

超聲前菌體的準(zhǔn)備：菌液離心后，先用PBS將菌沉淀洗2-3遍，然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體，裂解液的成分：50mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA，100mMNaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%TritonX-100。切記冰浴超聲！

如何判斷是否超聲完全：根據(jù)網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn)，一般有以下幾個(gè)方面：1，外觀判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。2，液體的粘滯性：超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

3，高速離心：有用高速離心檢測(cè)超聲破碎程度的（一般用6,000g10min,比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點(diǎn)）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。

4，染色：破碎后的菌液涂片，革蘭氏結(jié)晶紫溶液染色0.5分鐘，鏡檢。超聲后加入核酸酶消除核酸對(duì)蛋白的污染。一些需要注意的問(wèn)題：

1，蛋白以包涵體形式表達(dá)，追求的是高破碎率，要求細(xì)胞碎片很小，而另一種蛋白是可溶形式表達(dá)，所以細(xì)胞碎片不能很小，兩種情況要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分離。2，如果超聲時(shí)出現(xiàn)黑色沉淀，說(shuō)明超聲功率太強(qiáng)。3，超聲時(shí)間太長(zhǎng)、功率太高對(duì)蛋白活性肯定有影響。4，盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

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