細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

動(dòng)物細(xì)胞融合

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

⒈了解動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法。⒉學(xué)習(xí)化學(xué)融合的基本操作過(guò)程。

⒊觀察動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程中細(xì)胞的行為和變化。

【實(shí)驗(yàn)原理】

細(xì)胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為雙核或者多核細(xì)胞的過(guò)程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，包括病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融合和電激誘導(dǎo)融合。

⒈病毒誘導(dǎo)融合

仙臺(tái)病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細(xì)胞的融合。這類(lèi)病毒的被膜中含有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞融合，同時(shí)也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生融合。

⒉化學(xué)誘導(dǎo)融合

很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過(guò)程中相接觸的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合�；瘜W(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動(dòng)、植物細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學(xué)融合劑。

⒊電激誘導(dǎo)融合

包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊破細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過(guò)程易控制、融合概率高、無(wú)毒性、作用機(jī)制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。

【實(shí)驗(yàn)用品】

⒈材料

雞血紅細(xì)胞。⒉試劑

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s細(xì)胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。⒊器材

正置顯微鏡、離心機(jī)、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、注射器等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

⒈雞血紅細(xì)胞的制備和保存

用無(wú)菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再?gòu)碾u翼下靜脈取血0.5~1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使總量為4~5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內(nèi)。

⒉PEG誘導(dǎo)融合

⑴取保存的雞血，離心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化鈉溶液配制成5%~10%的懸液。

⑵稱(chēng)取1gPEG放入試管內(nèi)，在沸水浴中融化后，加入1ml預(yù)熱的Hank’s溶液，混勻，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，再加入5mlHank’s溶液混勻，然后以1000r/min離心5min，小心棄去上清液，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min內(nèi)滴加到雞紅細(xì)胞懸液中，邊加邊輕輕搖動(dòng)混勻。待PEG全部加入后靜置2~5min左右。

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⑸緩慢滴加6mlHank’s溶液以終止PEG的作用，混勻，靜置5min。

⑹1000r/min離心3min，棄上清液后，取一滴融合后的細(xì)胞懸液滴片，加蓋玻片鏡檢。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

視野中有部分細(xì)胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，但是沒(méi)有觀察到細(xì)胞核。此外，視野中有些細(xì)胞發(fā)生重疊，是由于稀釋不足造成的。

⒉注意事項(xiàng)

⑴制備的雞血紅細(xì)胞懸液的濃度不宜過(guò)高，否則細(xì)胞容易聚集，融合效果受影響。

⑵在離心之前，為了防止損壞儀器，應(yīng)配平離心機(jī)。具體方法為：把相對(duì)的兩個(gè)皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一個(gè)空的離心管，通過(guò)調(diào)節(jié)離心管中水的量來(lái)使天平達(dá)到平衡。

⑶在制片之前，應(yīng)對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行充分稀釋?zhuān)�以免�?xì)胞發(fā)生重疊，影響觀察。⑷在制片之后，如雞血紅細(xì)胞懸液過(guò)多，則應(yīng)用吸水紙吸去，以免弄臟物鏡。⑸為了觀察清楚，應(yīng)把光線調(diào)暗，并改用小光圈。

【相關(guān)鏈接】

細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用

⒈植物體細(xì)胞雜交

植物體細(xì)胞雜交（plantsomatic

hybridization）,又稱(chēng)原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過(guò)人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離

體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，未脫壁的兩個(gè)細(xì)胞是很難融合的，植物細(xì)胞只有在脫去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細(xì)胞融合也稱(chēng)為原生質(zhì)體融合。

⒉單克隆抗體

單克隆抗體是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細(xì)胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細(xì)胞（純系小鼠的腹水瘤型漿細(xì)胞）與已用抗原致敏并能分泌某種

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抗體的淋巴細(xì)胞（常用致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞，起作用的是其中的B細(xì)胞）融合而成的。用來(lái)使上述淋巴細(xì)胞致敏的抗原有人和動(dòng)物的T細(xì)胞、B細(xì)胞、紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、各種微生物或其他抗原物質(zhì)等。這種融合細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞能大量、無(wú)限繁殖的特性，又具有B細(xì)胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個(gè)B細(xì)胞克隆只針對(duì)一個(gè)

抗原決定簇產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的抗體，所以一個(gè)B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞，也只產(chǎn)生某種單一的抗體。采用適當(dāng)方法把雜交瘤細(xì)胞分離出來(lái)，進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細(xì)胞克隆，只產(chǎn)生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。若把能產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤進(jìn)行大量培養(yǎng)，或注入原系動(dòng)物腹腔中，則雜交瘤仍以腹水型方式生長(zhǎng)，在培養(yǎng)液或腹水中會(huì)含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術(shù)制備出來(lái)的單克隆抗體純度高、專(zhuān)一性強(qiáng)、效價(jià)高，使用時(shí)可免除不同細(xì)胞及微生物種或株間血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外，在研究細(xì)胞表面標(biāo)志、提純可溶性抗原、進(jìn)一步研究抗體的結(jié)構(gòu)和功能等方面都起著十分重要的作用。

⒊細(xì)胞治療

將自體細(xì)胞取出，經(jīng)培養(yǎng)3-5周后再移植（注射）到自體的病患部位，達(dá)到替代受損細(xì)胞修復(fù)之目的，細(xì)胞治療有長(zhǎng)期的效果，細(xì)胞能釋放自身的愈合和再生能力，治療疾病（腫瘤；臟器；器官；疤痕；皺紋;皮膚化等）。

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⒋核移植

核移植是將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過(guò)程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。培養(yǎng)一段時(shí)間后，在把發(fā)育中的卵母細(xì)胞移植到人或動(dòng)

物體內(nèi)的方法。核移植的細(xì)胞來(lái)源主要分為：供體細(xì)胞來(lái)源和受體細(xì)胞的來(lái)源兩種。核移植主要用于細(xì)胞移植和異種器官移植，細(xì)胞移植可以治療由于細(xì)胞功能缺陷所引的各種疾病。

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