細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告

小鼠脾細胞原代培養(yǎng)

姓名：杜旭學(xué)號：201*00230155系年級：201*級臨七一班同組者：趙偉日期：201*/4/25

【實驗?zāi)康摹?/p>

⒈學(xué)習(xí)并掌握動物細胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)。⒉了解原代細胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。⒊學(xué)習(xí)細胞計數(shù)及營養(yǎng)液的配制。

【實驗原理】

⒈細胞原代培養(yǎng)

原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個游離細胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。

細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。

⒉細胞死活鑒定死活細胞的鑒定方法有很多種，常用的有染色法和儀器分析法。染色法是常用的細胞死活鑒定方法，簡便，易于操作。不同的死活細胞鑒定方法有各自不同具體的反應(yīng)機理，但無論采用何種辦法，都是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異。

染色法分化學(xué)染色法和熒光染色法，根據(jù)染色機理的不同，染料或使死細胞著色，或使活細胞著色。●死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異主要包括：

☆死活細胞細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性的通過；而細胞死亡之后，細胞膜受損，通透性增加。常用的以臺盼藍鑒別細胞死活的方法就是利用了這一性質(zhì)。臺盼藍，又稱錐藍，是一種陰離子型染料，不能透過完整的細胞膜。所以經(jīng)臺盼藍染色后只能使死細胞著色，而活細胞不被著色。甲基藍有類似的染色機理。植物細胞的質(zhì)壁分離也可鑒定死活。

☆死活細胞在代謝上的差異：是采用美藍染料鑒定酵母細胞死活的依據(jù)。美藍是一種無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞中新陳代謝的作用，使細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍從藍色的氧化性變?yōu)闊o色的還原型，因此美藍染色后活的酵母細胞無色；而死細胞或代謝緩慢的老細胞，則因它們的無還原能力或還原能力極弱，使美藍處于氧化態(tài)，從而被染成藍色或淡藍色。

除此之外，還有一些細胞器的專有染料。如液泡系的專有染料中性紅。中性紅是一種低毒性染料，可以使活細胞液泡著紅色，而細胞質(zhì)和細胞核不被著色；死細胞的液泡不被著色或淺染，染料彌散于整個細胞中，細胞核和細胞質(zhì)被染成紅色。有時侯為了增加染色效果可以將兩種染料結(jié)合使用，如甲基藍-中性紅混合染色法。

【實驗用品】

⒈材料小白鼠⒉試劑

臺盼藍、伊紅、PBS緩沖液、細胞培養(yǎng)液（含生長因子）⒊器材

剪子、棉球、75%酒精、移液槍、無菌操作臺、正置光學(xué)顯微鏡、倒置光學(xué)顯微鏡、解剖盤、滴管、離

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心管、離心機、注射器、Eppendorf管、培養(yǎng)皿、酒精燈、塑料培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、血細胞計數(shù)板

【實驗步驟】

⒈取材

取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。

⒉分離脾細胞

用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用“L”型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用“L”型針頭輕輕刮出脾細胞。在均勻吹勻脾臟細胞。

吸取上述分離的單個脾細胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。⒊培養(yǎng)脾細胞

取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標(biāo)記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，吸取200ul脾細胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

⒋配制染液

用生理鹽水配成5%臺盼藍染液，備用。⒌染色

取0.5mL細胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液。混合。2-5min后將細胞放在血細胞計數(shù)板上觀察死活情況，注意不要有

氣泡產(chǎn)生，放大倍數(shù)為10x10。染色后活細胞不著色，死細胞顯示藍色。注意染色時間不能超過15min，否則染液將細胞毒殺。

⒍計數(shù)

在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算血細胞計數(shù)板的4個4小方格的細胞數(shù)量。包括細胞總數(shù)與死細胞數(shù)量。壓線者計上不計下，計左不計右。

⒎計算細胞活力

根據(jù)公式：細胞活力=(總細胞數(shù)-死細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%

【實驗結(jié)果】

第2頁

細胞生物學(xué)實驗報告

臺盼藍染色后的細胞（10x10）伊紅染色后的細胞（10x10）

總細胞數(shù)和活細胞數(shù)統(tǒng)計表（10×10）

項目自己培養(yǎng)細胞老師培養(yǎng)細胞總細胞數(shù)個/ml活細胞數(shù)個/ml細胞活力1.4×1067.5×1053.0×1055.5×10521.4%73.3%【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

本次實驗中我們小組自己培養(yǎng)細胞所測細胞活力為21.4%，并不算高，分析得應(yīng)有以下原因可能影響實驗結(jié)果（包括誤差）：

⑴若在無菌操作的過程中操作不規(guī)范，導(dǎo)致染菌，會極大的影響觀察，導(dǎo)致實驗失敗。

⑵若在離心分離呈單細胞的過程中離心機轉(zhuǎn)速過快或時間過長很可能會導(dǎo)致細胞破裂，導(dǎo)致小鼠脾細胞大量死亡。

⑶染色時間過長，或觀察時間過長都會導(dǎo)致染色試劑將細胞殺死，使細胞活力驟降，這是導(dǎo)致細胞活力比較低的重要原因。

⑷實驗中的一些操作不正確或不規(guī)范的情況、計算帶來的誤差等也會直接導(dǎo)致實驗誤差。⒉注意事項

⑴嚴(yán)格進行動物消毒，需用75%酒精消毒。

⑵嚴(yán)格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。⑶吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒；吸取液體時，避免碰撞。⑷離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。

⑸實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關(guān)閉工作窗。

⑹器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細胞。

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實驗六細胞膜的滲透性

一、實驗?zāi)康?/p>

了解細胞膜[1]的滲透性及各類物質(zhì)進入細胞的速度[2]

二、實驗原理

1、在等滲溶液中，細胞對各種溶質(zhì)的透過性不同。有的溶質(zhì)可以進

入，有的溶質(zhì)不能滲入。

2、滲入的溶質(zhì)能提高細胞的滲透壓，促進水分子進入細胞，引起溶

血現(xiàn)象[3]。

3、不同的溶質(zhì)滲入到細胞內(nèi)的速度不同，因此溶血時間也不同。

三、實驗材料

新鮮血液（雞血、豬血、牛血等）

四、實驗器材

試管（1.5cmX18cm）、試管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml燒杯（2個）、250ml容量瓶、移液槍、膠頭滴管、菜刀、吸球、電子天平、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、秒表

五、實驗藥品及試劑0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸銨、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝劑[4]

六、實驗步驟1、制備血液稀釋液

（1）抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

（2）血液稀釋液的制備：取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液

=1∶10）混合均勻，配制成經(jīng)肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（經(jīng)肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均勻，形成一種不透明的紅色液體[7]。

2、低滲溶液（空白對照）的觀察

取試管一只，加入10ml蒸餾水，然后再加入1ml稀釋的血液。注意觀察溶液顏色的變化。結(jié)果是溶液由不透明的紅色變?yōu)槌吻�。記錄下這個過程所要的時間。3、紅血球的滲透性

按表一的配制，分別在下列十種等滲溶液中進行實驗。輕輕搖動，注意有無顏色變化，是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生，記下時間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變?yōu)橥该鞒吻�，紅血球全部溶血所需時間），填入表一的空格中。4、顯微觀察

[1]何為細胞膜？[5]注意：這一步，動作要非常迅速，否則雞血會凝固。或者先把抗凝劑加入到燒杯中，再加入新鮮的[2]雞血，邊加邊震蕩即可。為何不同物質(zhì)進入細胞的速度不同？[6]為什么新鮮的雞血會凝固？[3]何為溶血現(xiàn)象？[7]為什么這一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝劑？（1）血液紅細胞的觀察

滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學(xué)顯微鏡觀察細胞的種類、形狀和顏色。

（2）細胞破碎的觀察

在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細胞的破裂。

七、實驗結(jié)果與分析

1、比較和分析你所觀察到的實驗結(jié)果，并解釋原因。

結(jié)果：

（1）在所提供的試劑中不溶血的有：

（2）在所提供的試劑中不完全溶血的有：（3）在所提供的試劑中完全溶血的有：結(jié)果分析與比較：結(jié)論：

2、繪制你所觀察到的血液細胞圖。

3、討論溶血實驗在研究中應(yīng)用的可能性。附1：試劑配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸銨需要＿＿＿＿＿＿克草酸銨，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克無水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低滲溶液下溶血現(xiàn)象的調(diào)查

編號12345678910試劑10ml0.17MNaCl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNaNO3+1ml稀釋的雞血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀釋的雞血10ml0.12M草酸銨+1ml稀釋的雞血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀釋的雞血10ml0.32M甘油+1ml稀釋的雞血10ml0.32M乙醇+1ml稀釋的雞血10ml0.32M丙酮+1ml稀釋的雞血是否溶血時間

附3：溶血結(jié)果的判斷

（1）不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細胞完好。（2）不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細胞破裂。（3）完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞全成碎片。

附4：細胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換示意圖

原始生命向細胞進化所獲得的重要形態(tài)特征之一，是生命物質(zhì)外面出現(xiàn)了一層膜性結(jié)構(gòu)，即細胞膜。細胞膜和細胞內(nèi)膜系統(tǒng)總稱為生物膜(biomembrane)。

細胞膜(cellmembrane)，又稱原生質(zhì)膜，是細胞結(jié)構(gòu)中分隔細胞內(nèi)、外不同介質(zhì)和組成成分的界面。其厚度通常為7～8nm，由脂類和蛋白質(zhì)組成。一般蛋白質(zhì)占60%-80%，類脂占20%-40%，碳水化合物約占5%。關(guān)于細胞膜的結(jié)構(gòu)模型，流體鑲嵌模型是目前被最廣泛接受和認可的觀點。該模型由美國加州大學(xué)的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。該模型突出了膜的流動性和不對稱性，其結(jié)構(gòu)特征是：生物膜的骨架是磷脂雙分子層，其中磷脂分子的疏水性尾部相對，極性頭部朝向水相。蛋白質(zhì)或嵌在脂雙層表面，或嵌在其內(nèi)部，或橫跨整個脂雙層，表現(xiàn)出分布的不對稱性。根據(jù)在膜上的位置不同，膜蛋白可分為兩類：通過強疏水或親水作用同膜脂牢固結(jié)合不易分開的，稱為整合蛋白(integralprotein)或內(nèi)在蛋白；附著在膜表層，與膜結(jié)合比較疏松容易分離的，稱為外周蛋白(peripheralprotein)。細胞膜的表面還有糖類分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂雙層具有流動性，故蛋白質(zhì)分子也可以在脂雙層中橫向移動；又因膜的內(nèi)外表面上脂類和蛋白質(zhì)的分布不均勻，反映了膜兩側(cè)的功能不同。

細胞膜是細胞與周圍環(huán)境和細胞與細胞間進行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道。其最重要的特性是半透性，或稱選擇透過性，對進出入細胞的物質(zhì)有很強的選擇透過性。這是細胞膜最基本的一種功能，如果喪失了這種功能，細胞就會死亡。細胞膜的功能有：

1)分隔形成細胞和細胞器，為細胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，膜的面積大大

增加，提高了發(fā)生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜兩側(cè)的水溶性物質(zhì)不能自由通過；3)選擇性物質(zhì)運輸，伴隨著能量的傳遞；

4)生物功能：激素作用、酶促反應(yīng)、細胞識別、電子傳遞等；5)物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能：細胞與周圍環(huán)境之間的物質(zhì)交換，是通過細胞膜的轉(zhuǎn)運功能實現(xiàn)的，其主要轉(zhuǎn)運方式有四種，即單純擴散、易化擴散、主動轉(zhuǎn)運、入胞和出胞作用。6)細胞膜的受體功能：受體是細胞識別和結(jié)合化學(xué)信息的特殊結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。實驗八細胞融合實驗?zāi)康?/p>

掌握細胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細胞的方法以及細胞融合率的計算。實驗用品

1.材料雞紅細胞

2.器材和儀器普通光學(xué)顯微鏡、普通低速離心機、恒溫水浴箱、刻度離心管、試管、載玻片、蓋玻片

3.試劑50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理鹽水實驗內(nèi)容

一、原理

細胞融合(Cellfusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的過程。人工誘導(dǎo)的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細胞融合，也能產(chǎn)生種間細胞的融合，因此細胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

細胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因為它易得、簡便，且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機制尚不完全清楚，它可能引起細胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。二、方法

1.取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。2.稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml預(yù)熱的37℃Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中備用。

3.取上述10％的雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，沿離心管壁滴加50％PEG溶液，邊加邊晃動試管使之混勻，37℃水浴20min。

4.取出離心管，緩慢滴加9mlHanks液以終止PEG的作用，800g離心3min，棄上清。5.用貼壁的液體重懸細胞，取一滴制成滴片，加蓋片鏡檢。結(jié)果：在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的雞紅細胞膜融合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的雞紅細胞。三、融合率的計算

在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。公式如下：

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