細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

線粒體的活體染色與觀察

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

⒈掌握線粒體活體染色原理及方法。

⒉觀察和了解動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與分布特點(diǎn)。

【實(shí)驗(yàn)原理】

⒈線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場(chǎng)所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的�；铙w染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細(xì)胞生命活動(dòng)的一種染色方法。詹納斯綠B（JanusgreenB）是線粒體的專一性活體染色劑。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶系使染料保持氧化狀態(tài)呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。不同細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。在電子顯微鏡下，線粒體的外形多樣，如圓形、橢圓形、啞鈴形和桿狀。線粒體的數(shù)目與細(xì)胞類型和細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)，線粒體多聚集在細(xì)胞生理功能旺盛的區(qū)域。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶能使詹納新綠染料始終保持在氧化狀態(tài)而呈藍(lán)色，周圍細(xì)胞內(nèi)的染料卻被還原成無色的色基，在進(jìn)行細(xì)胞的體外染色時(shí)，至少要使材料在詹納斯綠B染料中染色15min后再蓋上蓋玻片，以使材料充分氧化。

⒉活體染色是指用染料標(biāo)記生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，同時(shí)即不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)也不會(huì)產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化導(dǎo)致細(xì)胞的死亡�；钊炯夹g(shù)可用來研宄生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)�；铙w染色之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起作用。堿性燃料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子；而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們被此就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料都可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料配成稀的溶液來使用。一般以堿性染料最為常用，因?yàn)閴A性染料具有溶解在類脂質(zhì)的特性，易于被細(xì)胞吸收，如中性紅、詹鈉斯綠B、次甲基藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、亮焦油紫等。其中詹鈉斯綠和中性紅兩種堿性染料是活體染色劑中最常用的染料，分別對(duì)線粒體和液泡系有特異性的染色。詹納斯綠B這種堿性染料是活體染色中重要的材料，對(duì)線粒體的染色有專一性，可專一性地對(duì)線粒體進(jìn)行活染，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原成無色的色基。

【實(shí)驗(yàn)用品】

⒈材料小白鼠⒉器材

解剖盤、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片、滴管、雙凹片、小燒杯、顯微鏡。⒊試劑

1/500詹納綠B染液、Ringer試劑（NaCl：0.85%；KCl：0.03%；CaCl2：0.033%）。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

⒈用斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中。剪開腹腔，取出肝臟，選取邊緣較薄的肝組織0.5cm3，放入小燒杯中，用Ringer液沖洗去血污。

⒉滴加1/500詹納綠B溶液于雙凹片的凹穴中，再將上述洗凈的肝組織移入染液中，染色20-30min。以組織塊邊緣被染成藍(lán)綠色為準(zhǔn)。

⒊吸去染液，將肝組織重置小燒杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，用剪刀將組織充分剪碎制成懸液。⒋取上述細(xì)胞懸液滴片，加上蓋玻片，在高倍鏡下觀察。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

第1頁細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

⒈結(jié)果

小鼠肝細(xì)胞質(zhì)中的線粒體被染成藍(lán)綠色（理想狀態(tài)下），且分布均勻。⒉圖像

【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

⑴在理想狀態(tài)下，小鼠肝細(xì)胞質(zhì)中的線粒體應(yīng)該被染成藍(lán)綠色，但是在實(shí)際觀察中，線粒體呈淺綠色甚至無色。可能原因有：①染色時(shí)間不夠，使染色不夠充分。②肝組織塊剪得太大太厚了，使得染料透過速度太慢，最終使得大部分的細(xì)胞未染上色。③根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理要求，染色劑的濃度要求極稀。這本身就讓染色過程具有了一定難度。

⑵在顯微鏡下觀察時(shí)，可以看到紅細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于線粒體的數(shù)量。出現(xiàn)這種情況可能的原因有：①在處死小鼠時(shí)，放血不夠充分，導(dǎo)致大量血液淤留在了肝臟中，使最終視野中紅細(xì)胞過多。②取出肝組織塊后，用Ringer液未將血污沖洗干凈，使其部分殘留在肝組織塊表面，并最終混在了細(xì)胞懸液內(nèi)。

⒉討論

使用肝細(xì)胞的緣由

⑴線粒體含量較多，每個(gè)肝細(xì)胞有1000-201*個(gè)線粒體。⑵長(zhǎng)度適合觀察，約5μm。

⑶肝臟較軟，易于破碎，并且適于快速提取，因而利于保持線粒體活性。

⑷但就以上某一條而言，均有其他部位可以替代肝臟，但若全面比較三個(gè)條件，則肝臟為最佳。⒊注意事項(xiàng)

⑴在從小鼠體內(nèi)取肝組織塊時(shí)要盡量快，從而能夠保證它更高的活性。

⑵染色時(shí)要使組織塊上面部分半露在染液外，不可完全淹沒，以便使線粒體酶系得到氧化。⑶在選取肝組織片時(shí)要在處于邊緣，且為由薄到厚的地方選取。

⑷染色結(jié)束后，加入的Ringer液的量不能太多，只需要?jiǎng)偵w過肝組織塊即可。如果量太多，則在剪組織塊的時(shí)候會(huì)造成其上浮，從而不易剪碎。

⑸觀察前要將肝組織充分剪碎，制片時(shí)要吸取上懸液，使游離的細(xì)胞或細(xì)胞群留在載玻片上，而要避免吸取稍大的組織塊。

【拓展實(shí)驗(yàn)】

人口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的活體染色與觀察

Ⅰ.取干凈的載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/500詹納斯綠B染液。

Ⅱ.實(shí)驗(yàn)者用牙簽在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片上的染液中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

Ⅲ.在低倍鏡下，選擇平展的口腔黏膜上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察�？梢姳馄綘钌掀ぜ�(xì)胞細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即為線粒體。

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實(shí)驗(yàn)六細(xì)胞膜的滲透性

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞膜[1]的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度[2]

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、在等滲溶液中，細(xì)胞對(duì)各種溶質(zhì)的透過性不同。有的溶質(zhì)可以進(jìn)

入，有的溶質(zhì)不能滲入。

2、滲入的溶質(zhì)能提高細(xì)胞的滲透壓，促進(jìn)水分子進(jìn)入細(xì)胞，引起溶

血現(xiàn)象[3]。

3、不同的溶質(zhì)滲入到細(xì)胞內(nèi)的速度不同，因此溶血時(shí)間也不同。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮血液（雞血、豬血、牛血等）

四、實(shí)驗(yàn)器材

試管（1.5cmX18cm）、試管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml燒杯（2個(gè)）、250ml容量瓶、移液槍、膠頭滴管、菜刀、吸球、電子天平、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、秒表

五、實(shí)驗(yàn)藥品及試劑0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸銨、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝劑[4]

六、實(shí)驗(yàn)步驟1、制備血液稀釋液

（1）抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

（2）血液稀釋液的制備：取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液

=1∶10）混合均勻，配制成經(jīng)肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（經(jīng)肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均勻，形成一種不透明的紅色液體[7]。

2、低滲溶液（空白對(duì)照）的觀察

取試管一只，加入10ml蒸餾水，然后再加入1ml稀釋的血液。注意觀察溶液顏色的變化。結(jié)果是溶液由不透明的紅色變?yōu)槌吻濉Ｓ涗浵逻@個(gè)過程所要的時(shí)間。3、紅血球的滲透性

按表一的配制，分別在下列十種等滲溶液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。輕輕搖動(dòng)，注意有無顏色變化，是否有溶血現(xiàn)象發(fā)生，記下時(shí)間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變?yōu)橥该鞒吻�，紅血球全部溶血所需時(shí)間），填入表一的空格中。4、顯微觀察

[1]何為細(xì)胞膜？[5]注意：這一步，動(dòng)作要非常迅速，否則雞血會(huì)凝固�；蛘呦劝芽鼓齽┘尤氲綗�杯中，再加入新鮮的[2]雞血，邊加邊震蕩即可。為何不同物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度不同？[6]為什么新鮮的雞血會(huì)凝固？[3]何為溶血現(xiàn)象？[7]為什么這一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝劑？（1）血液紅細(xì)胞的觀察

滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的種類、形狀和顏色。

（2）細(xì)胞破碎的觀察

在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞的破裂。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1、比較和分析你所觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并解釋原因。

結(jié)果：

（1）在所提供的試劑中不溶血的有：

（2）在所提供的試劑中不完全溶血的有：（3）在所提供的試劑中完全溶血的有：結(jié)果分析與比較：結(jié)論：

2、繪制你所觀察到的血液細(xì)胞圖。

3、討論溶血實(shí)驗(yàn)在研究中應(yīng)用的可能性。附1：試劑配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸銨需要＿＿＿＿＿＿克草酸銨，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克無水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低滲溶液下溶血現(xiàn)象的調(diào)查

編號(hào)12345678910試劑10ml0.17MNaCl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀釋的雞血10ml0.17MNaNO3+1ml稀釋的雞血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀釋的雞血10ml0.12M草酸銨+1ml稀釋的雞血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀釋的雞血10ml0.32M甘油+1ml稀釋的雞血10ml0.32M乙醇+1ml稀釋的雞血10ml0.32M丙酮+1ml稀釋的雞血是否溶血時(shí)間

附3：溶血結(jié)果的判斷

（1）不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細(xì)胞完好。（2）不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細(xì)胞破裂。（3）完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全成碎片。

附4：細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換示意圖

原始生命向細(xì)胞進(jìn)化所獲得的重要形態(tài)特征之一，是生命物質(zhì)外面出現(xiàn)了一層膜性結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜。細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)總稱為生物膜(biomembrane)。

細(xì)胞膜(cellmembrane)，又稱原生質(zhì)膜，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中分隔細(xì)胞內(nèi)、外不同介質(zhì)和組成成分的界面。其厚度通常為7～8nm，由脂類和蛋白質(zhì)組成。一般蛋白質(zhì)占60%-80%，類脂占20%-40%，碳水化合物約占5%。關(guān)于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模型，流體鑲嵌模型是目前被最廣泛接受和認(rèn)可的觀點(diǎn)。該模型由美國(guó)加州大學(xué)的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。該模型突出了膜的流動(dòng)性和不對(duì)稱性，其結(jié)構(gòu)特征是：生物膜的骨架是磷脂雙分子層，其中磷脂分子的疏水性尾部相對(duì)，極性頭部朝向水相。蛋白質(zhì)或嵌在脂雙層表面，或嵌在其內(nèi)部，或橫跨整個(gè)脂雙層，表現(xiàn)出分布的不對(duì)稱性。根據(jù)在膜上的位置不同，膜蛋白可分為兩類：通過強(qiáng)疏水或親水作用同膜脂牢固結(jié)合不易分開的，稱為整合蛋白(integralprotein)或內(nèi)在蛋白；附著在膜表層，與膜結(jié)合比較疏松容易分離的，稱為外周蛋白(peripheralprotein)。細(xì)胞膜的表面還有糖類分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂雙層具有流動(dòng)性，故蛋白質(zhì)分子也可以在脂雙層中橫向移動(dòng)；又因膜的內(nèi)外表面上脂類和蛋白質(zhì)的分布不均勻，反映了膜兩側(cè)的功能不同。

細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境和細(xì)胞與細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要通道。其最重要的特性是半透性，或稱選擇透過性，對(duì)進(jìn)出入細(xì)胞的物質(zhì)有很強(qiáng)的選擇透過性。這是細(xì)胞膜最基本的一種功能，如果喪失了這種功能，細(xì)胞就會(huì)死亡。細(xì)胞膜的功能有：

1)分隔形成細(xì)胞和細(xì)胞器，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，膜的面積大大

增加，提高了發(fā)生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜兩側(cè)的水溶性物質(zhì)不能自由通過；3)選擇性物質(zhì)運(yùn)輸，伴隨著能量的傳遞；

4)生物功能：激素作用、酶促反應(yīng)、細(xì)胞識(shí)別、電子傳遞等；5)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能：細(xì)胞與周圍環(huán)境之間的物質(zhì)交換，是通過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)功能實(shí)現(xiàn)的，其主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式有四種，即單純擴(kuò)散、易化擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、入胞和出胞作用。6)細(xì)胞膜的受體功能：受體是細(xì)胞識(shí)別和結(jié)合化學(xué)信息的特殊結(jié)構(gòu)，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)八細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握細(xì)胞融合原理、應(yīng)用PEG融合細(xì)胞的方法以及細(xì)胞融合率的計(jì)算。實(shí)驗(yàn)用品

1.材料雞紅細(xì)胞

2.器材和儀器普通光學(xué)顯微鏡、普通低速離心機(jī)、恒溫水浴箱、刻度離心管、試管、載玻片、蓋玻片

3.試劑50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理鹽水實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

一、原理

細(xì)胞融合(Cellfusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇，因?yàn)樗�易得、�?jiǎn)便，且融合效果穩(wěn)定。PEG的促融機(jī)制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。二、方法

1.取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。2.稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml預(yù)熱的37℃Hanks液混勻制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中備用。

3.取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml放入離心管中，沿離心管壁滴加50％PEG溶液，邊加邊晃動(dòng)試管使之混勻，37℃水浴20min。

4.取出離心管，緩慢滴加9mlHanks液以終止PEG的作用，800g離心3min，棄上清。5.用貼壁的液體重懸細(xì)胞，取一滴制成滴片，加蓋片鏡檢。結(jié)果：在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的雞紅細(xì)胞。三、融合率的計(jì)算

在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。公式如下：

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