植物病理學實習總結

植物病理學實習總結

實習時間：一周

實習地點：河南農(nóng)業(yè)大學校區(qū)及三區(qū)，毛莊，森林公園及浮

戲山

實習目的：學習實地認識各種植物病害并采集標本，學習制

作標本的方法，學習用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌和細菌，學習制作玻片并觀察玻片來判斷病原物是什么。

實習中認識的病害及病原物介紹：

1芍藥白粉病

癥狀：在葉面產(chǎn)生白色、近圓形的白粉狀霉斑，白斑向四周蔓延，連接成邊緣不整齊的大片白粉斑，其上布滿白色至灰白色粉狀物。葉上布滿白粉狀霉,即病菌的菌絲體、分生孢子梗及分生孢子。發(fā)病后期有時葉片上產(chǎn)生黑褐色小點,為病菌的有性世代閉囊殼。2南瓜霜霉病

發(fā)病初期葉片背面出現(xiàn)水浸狀黃色斑點，病斑逐漸擴大后，受葉脈限制呈黃褐色不規(guī)則的多角形病斑。在潮濕條件下，病斑背面長有灰黑色霉層。發(fā)病重時，病

斑連成片，使葉片變黃干枯、易破碎，植株一片枯黃病原菌：真菌病害，病菌以在土壤或病株殘體上的孢子囊及潛

伏在種子內(nèi)的菌絲體越冬或越夏。以孢子囊隨風雨進行傳播，從寄主葉片表皮直接侵入，引起初次侵染，以后隨氣流和雨水進行多次再侵染。

3番茄晚疫病

葉片染病多從葉尖、葉緣開始病葉出現(xiàn)水浸狀暗綠色病

斑，當向葉脈和莖蔓延后莖桿染病產(chǎn)生長條狀暗褐色凹陷條斑。

病原物：致病疫霉菌，菌絲絲狀，分隔

4番茄早疫病

主要危害葉片，在莖基部產(chǎn)生暗褐色病斑，稍凹陷有輪紋。多從植株下部葉片向上發(fā)展，初呈水浸狀暗綠色病斑，擴大后呈圓形或不規(guī)則形的輪紋斑，邊緣多具淺綠色或黃色的暈環(huán)，中部呈同心輪紋。

病原物：早疫病是由茄鏈格孢菌侵染所致，在真菌分類中，屬于半知菌門鏈格孢屬。

番茄早疫病和番茄晚疫病的區(qū)別：番茄早疫病在生長期都可

以發(fā)病。侵害葉、莖、果實各個部位，以葉片和莖葉分枝處最易發(fā)病。病害一般多從下部葉片開始發(fā)生，逐漸向上擴展。葉片上最初可見到深褐色小斑點，擴大后呈圓形或近圓形，外圍有黃色或黃綠色的暈環(huán)，病斑灰褐色，有深褐色的同心輪紋，有時多個病斑連在一起，形成大形不規(guī)則病斑。番茄晚疫病在番茄的整個生育期均可發(fā)生，幼苗、莖、葉、和果實均可受害，以葉和青果受害為重。幼苗染病，病斑由葉向葉脈和莖蔓延，使莖變細并呈黑褐色，植株萎蔫或倒伏；葉片受害多從葉尖、葉緣開始發(fā)病，初為暗綠色水浸狀不規(guī)則病斑，擴大后轉(zhuǎn)為褐色。5煙草花葉病

葉脈兩側(cè)葉肉組織漸呈淡綠色。病毒在葉片組織內(nèi)大量增

殖，使部分葉肉細胞增大或增多，出現(xiàn)葉片薄厚不勻，顏色黃綠相間，呈花葉狀。后花葉斑駁程度加大，并現(xiàn)大面積深褐色壞死斑，中下部老葉尤甚，發(fā)病重的葉片皺縮、畸形。

病原物：有病毒引起

6洋蔥紫斑病

危害初期呈水浸狀白色點斑，病斑擴大快，迅速形成寬1～

3厘米、長2～4厘米紡錘形的凹陷斑，先為淡褐色，隨后變?yōu)楹稚�至晴紫色，周圍具有黃色暈圈。此后有的逐漸褪色并形成同心輪紋，濕度大時斑面上產(chǎn)生黑褐色煤粉狀霉。

病原菌稱為蔥鏈格孢菌。

7梨銹病

葉片被害后葉片正面產(chǎn)生圓形小病斑，隨著病斑的擴大，病斑中央產(chǎn)生蜜黃色微凸的小粒點（病菌性孢子器），潮濕時小粒點上溢出淡黃色黏液，之后病斑組織變肥厚，正面凹陷，背面隆起并長出幾根至十幾根灰白色或淡黃色的細管狀物即銹孢子器，內(nèi)有大量褐色銹孢子，成熟后從銹孢子器頂端開列散出。

病原物：病原屬擔子菌亞門膠柄銹屬真菌。性孢子器葫蘆形，埋生于表皮下；性孢子紡錘形，單胞無色。銹子器長簡形，叢生于葉背面。銹孢子近圓形，橙黃色，表面有瘤狀細胞。8花生褐斑病

初為褪綠小點，后擴展成近圓形或不規(guī)則形小斑，病斑較黑斑病大而色淺，葉正面呈暗褐或茶褐色，背面呈褐或黃褐色，病斑周圍有亮黃色暈圈。濕度大進病斑上可見灰褐色粉狀霉層。

病原物：落花生尾孢，屬半知菌亞門真菌。子座多散生于病斑正面，深褐色。分生孢子梗叢生或散生于子座上，黃褐色，病菌以子座、菌絲團或子囊腔在病殘體上越冬。翌年條件適宜，產(chǎn)生分生孢子，借風雨傳播進行初侵染和再浸染。菌絲直接伸入細胞間隙和細胞內(nèi)吸取營養(yǎng)。9茄子黃萎病

初期葉緣及葉脈間出現(xiàn)褪綠斑,病株初在晴天中午呈萎蔫狀,早晚尚能恢復,經(jīng)一段時間后不再恢復,葉緣上卷變褐脫落,病株逐漸枯死,

病原物：茄子黃萎病病菌為半知菌門真菌的大麗輪枝菌，病菌分生孢子梗直立,細長,上有數(shù)層輪狀排列的小梗,梗頂生橢圓形、單胞、無色的分生孢子。10桃縮葉病

嫩葉剛伸出時就顯現(xiàn)卷曲狀，葉片逐漸開展，卷曲及皺縮的程度隨之增加，致全葉呈波紋狀凹凸，嚴重時葉片完全變形。

桃縮葉病的病原物為畸形外囊菌。11黃瓜靶斑病

黃瓜靶斑病又稱“黃點子病”，起初為黃色水浸狀斑點，發(fā)病中期病斑擴大為圓形或不規(guī)則形，易穿孔，葉正面病斑粗糙不平，病斑整體褐色，中央灰白色、半透明。后期病斑直徑可達10~15毫米，病斑中央有一明顯的眼狀靶心。

病原物：由半知菌的棒孢菌引起的病害。12南瓜角斑病

主要為害葉片。葉片上產(chǎn)生多角形或不規(guī)則形病斑，受葉脈

限制。大小1～5毫米，初為淺褐色，后中間變灰白色，邊緣明顯，中心稍下凹，病斑周圍不形成暈圈，后期病部正背長出很多小黑點。嚴重時病斑融合成片，致葉片早枯。

病原菌：真菌半知菌門瓜角斑殼針孢。

在實習的過程中，我們認識了很多植物病害，采集了很多標本，對于不能肯定的植物病害，我們小組成員查閱了很多資料，并在玻璃皿中培養(yǎng)了許多未知病原物，然后分離出病原物，做成玻片在顯微鏡下觀察病菌形態(tài)，然后判斷是屬于那個門哪個科。我們還進行了細菌和真菌的培養(yǎng)，分離土壤微生物。在實踐中，我們不僅學到了植物病害方面的知識，還增強了實際動手操作能力。

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植物病理學實習總結報告

學院：資源環(huán)境學院年級：201*級

專業(yè)：植物保護微生物工程組別：第三小組姓名：戴澤翰學號：201*30201*08

指導老師：李敏慧、劉瓊光、周國輝、徐大高、楊媚、

謝輝、何藝郡目錄

一、前言--------------------------------------------------------3二、實習目的與意義----------------------------------------3三、實習內(nèi)容與方法----------------------------------------3

實驗一植物病害標本的采集和制作------------4實驗二植物病原的分離與培養(yǎng)-------------------8實驗三植物病原真菌玻片標本制作------------12實驗四植物病原線蟲的分離及形態(tài)觀察------14實驗五植物病毒（香蕉束頂病毒）檢測------15四、實習（驗）結果與分析------------------------------18五、收獲與體會----------------------------------------------19六、參考文獻-------------------------------------------------20

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植物病理學實習總結報告

戴澤翰201*30201*0808植保微生物1班

一、前言

植物病理學是主要研究引起農(nóng)作物病害發(fā)生的各種生物與非生物引子及其致病機制、病原物與寄主間相互關系和控制病害發(fā)生、減輕發(fā)病程度、減少病害所致?lián)p失的原理及具體措施的一個重要農(nóng)業(yè)學科。學習基本的植物病理學、流行學知識，掌握常見農(nóng)業(yè)病害鑒別和病原物采集、分離等技能，是對作為高等農(nóng)科院校植保專業(yè)學生提出的要求。為鞏固和印證所學的植物病理知識，增強學生對本地區(qū)主要作物及主要植物病害的直觀認識，我校資環(huán)學院為植保專業(yè)安排了植物病理學課的實習，以加強學生理論結合實際，提高分析問題和解決問題的能力，

二、實習目的與意義

(一)鞏固和印證所學植物病理學基礎理論知識(二)熟練掌握植物病理學實驗操作技能

(三)通過室內(nèi)外觀察，認識本地區(qū)主要作物及主要植物病害的形態(tài)特征(四)加強理論聯(lián)系實際，提高分析問題和解決問題的能力

三、實習內(nèi)容與方法

(一)植物病害標本的采集和制作及常見病害鑒定(二)植物病原的分離與培養(yǎng)

(三)植物病原真菌玻片標本制作

(四)線蟲病害標本的采集、分離與鑒定(五)植物病毒（香蕉束頂病毒）檢測

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實驗一植物病害標本的采集和制作及常見病害鑒定

一、實驗目的

植物病害標本是植物病害及其分布的事務性記載，有了標本即可在室外觀察的基礎上，開展室內(nèi)各方面的工作，特別是病害診斷和病原物的分離鑒定工作，沒有合格的標本更無從談起。因此，病害標本的采集和制作是植物病害研究和實驗的基本建設工作，植病標本的采取和制作是植保人員必須掌握的的基本技術之一。通過本次標本采集和制作實踐實習，學習標本采集和制作的常用方法

二、實驗步驟

（一）標本采集

1、外出實習地點(1)華農(nóng)大農(nóng)場

(2)華農(nóng)大增城寧西基地(3)廣州白云區(qū)蔬菜地

2、采集方式與標本采集要求

(1)直接從病害植株以手、刀、剪刀提取病樣。

(2)癥狀應具有典型性。標本應有典型的病狀和病癥，最好有不同階段和不同部位的癥狀。這樣才能使標本起到幫助人們正確識別病害的作用。

(3)真菌病害標本應采集有子實體的。對于真菌病害來說，鑒定病原物是正確診斷病害的重要條件之一，因此要求真菌病害標本必須有病菌的子實體。

(4)每種標本上的病害種類應力求單純。如果一份標本上同時有幾種病害，就會混淆視線，影響鑒定，這樣就沒有適用價值。

(5)采集時應進行必要的記載，以輔助標本不足。記載的內(nèi)容應包括：寄主名稱、發(fā)病情況、環(huán)境條件、以及采集日期、地點、采集人姓名等。

(6)寄主的鑒定也很重要，有些病害如銹病，不知道寄主是無法鑒定的。對于不認識的寄主植物。應將寄主鑒定所必需的部分，如枝、葉、花及果實等部分都采集齊全。(7)適于干制的標本，應隨采隨壓于標本夾中，尤其容易干燥卷縮的標本如水稻、小麥的葉片，最好立即夾在厚書本中，否則葉片失水卷縮后無法展平。

(8)柔軟多汁或腐爛的標本，應用紙袋或標本紙包好，然后置于標本箱中，以免污染和擠壞標本，妨礙鑒定。

(10)黑白粉病、銹病、霜霉類標本等由于病菌孢子極易散落，所以采集時應用紙袋或標本紙包好后，再置于采集夾中或采集箱中，以免混雜妨礙鑒定。(11)每種標本采集的數(shù)量不宜過少，以便在制作和應用中留有余地。

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（二）標本制作

1本實驗采取干制法制作臘葉標本。

2基本原理：利用標本紙快速把病樣標本脫水，并加壓把標本壓成美觀的平面標本。干燥愈快愈能保持標本原有的色澤。

3操作：

（1）把適于壓制的病樣如植物的莖、葉以及去掉果肉的果皮等，整形后分層壓在標本夾中，放一層標本紙（每層3-4張）放一層標本，每個標本夾的總厚度以三寸左右厚為宜，用繩子將標本夾壓緊。

（2）每隔一至兩天就打開標本夾檢查標本紙的干濕程度，及時更換較濕的標本紙。在第一次換紙時，同時將標本整形，使其達到既美觀又便于觀察的要求。（3）將完全干燥的病樣標本用透明膠、雙面膠等固定在白紙上，紙張右下角寫上標簽（標簽內(nèi)容依次為寄主名稱、病害名稱、病原物中文名及拉丁文學名、采集地點、采集人姓名、采集日期、）

（三）實驗結果

1、制作了絲瓜霜霉病、玉米小斑病、水稻紋枯病、水稻白葉枯病、玉米黑粉病、茶輪斑病、竹黑痣病、玫瑰黑斑病、稻曲病的標本。（見圖1-1,1-2）

圖1-15

圖1-2

2通過外觀形態(tài)觀察及顯微觀察結合，鑒定出了一些常見的病害：

病害名稱水稻白葉枯病水稻細菌性條斑病玉米銹病玉米小斑病花生黑斑病花生銹病花生褐斑病南瓜花葉病毒病南瓜炭疽病萵苣霜霉病水稻紋枯病番茄晚疫病豇豆煤霉病辣椒炭疽病6

鑒定狀態(tài)已鑒定已鑒定未鑒定（顯微觀察僅見夏孢子）已鑒定已鑒定未鑒定（顯微觀察僅見夏孢子）未鑒定未鑒定未鑒定已鑒定已鑒定未鑒定未鑒定未鑒定絲瓜白粉病絲瓜炭疽病白菜軟腐病玉米大斑病茶炭疽病茶輪斑病茶白粉病茶藻斑病茶云紋葉枯病香蕉枯萎病水稻胡麻葉斑病芋疫病白菜霜霉病水稻葉鞘腐敗病白菜黑腐病茄褐紋病玫瑰黑斑病番茄早疫病甘藍黑腐病竹子黑痣病毛豆銹病已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定已鑒定未鑒定已鑒定未鑒定已鑒定未鑒定已鑒定未鑒定已鑒定已鑒定已鑒定未鑒定已鑒定已鑒定未鑒定（顯微觀察僅見夏孢子）表1-1

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實驗二植物病原的分離與培養(yǎng)

一、實驗目的

在研究病原菌的形態(tài)、生理、生態(tài)以及病原菌對寄主植物的致病性等多種試驗中，常常需要病原菌的純培養(yǎng)物。然而，在自然情況下，病原菌通常是與其他雜菌混生在一起的，從受病組織或其他基物中將病原菌單獨分選出來，叫作分離。分離和培養(yǎng)是植病實驗室最基本的操作技術之一。通過本次實驗學習植物病原菌分離培養(yǎng)的原理和常用的方法。

二、實驗前準備

(一)清潔環(huán)境：

分離工作嚴格說應在無菌條下進行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設施。若限于條件實驗只能在普通房間進行時，必須對房間進行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。地上多灑些水，以消除室內(nèi)塵埃，分離開始前準備好一切用品，避免工作過程中頻繁走動，以破壞環(huán)境帶來雜菌，工作臺上鋪好濕毛巾，點燃酒精燈。

(二)實驗材料及用品準備

1病組織材料

玉米小斑病病葉水稻紋枯病病葉水稻白葉枯病病葉

2用品準備

0.1%升汞溶液(廣口瓶盛裝)；95%酒精(廣口瓶盛裝)；1000ppm鏈霉素；

瓶裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；瓶裝馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基；

此外，還有以下備品，無菌水1瓶，滅菌培養(yǎng)皿6付，滅菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和鑷子各1把，移植環(huán)，移植鉤、酒精燈、琺瑯盤和試管架各1個，毛巾1條，玻璃鉛筆1支及火柴等。

三、實驗步驟

（一）玉米小斑病與水稻紋枯病原分離（組織分離法）

1、取樣。取患玉米小斑病、水稻紋枯病的病樣，分別切取材料2~3mm長的病健交界處。

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2、表面消毒。將病組織用清水洗凈，接著放到75%酒精里浸泡30s，然后放到0.1%升汞里浸泡0.5~1min，最后用無菌水洗3次。

3、培養(yǎng)。把材料放到PDA培養(yǎng)基上并在25℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)2~3天，觀察結果。

（二）水稻白葉枯病原分離（稀釋分離法）

1消毒：將剪下的植物組織用清水洗干凈，然后用75%的酒精浸泡30秒，在用0.1%的升汞洗0.5~1分鐘，最后用無菌水洗滌3次。2搗碎：取用一個滅菌小皿，向內(nèi)滴加1~2滴無菌水，然后滅菌剪刀剪碎已洗滌好的組織，放入水中靜置5-10分鐘，制備成菌懸液。

3劃線：用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液進行平板劃線。

4培養(yǎng)：將平板倒置，寫標簽，至于28-30攝氏度培養(yǎng)，2天后，觀察分離結果。

四、實驗結果與分析

玉米小斑病分離培養(yǎng)的很成功，但水稻紋枯病全部都失敗了。

玉米小斑病病原平板培養(yǎng)菌落的形態(tài)見圖2-1。菌落大體呈圓形，營養(yǎng)菌絲呈黑色，以接種樣葉為中心輻射生長，菌落較大型�？拷�菌落中心長有白色霉狀物。

水稻紋枯病病菌分離培養(yǎng)失敗，我認為有以下原因：首先、病樣選取有問題。我們組選取的病葉保濕措施做得不夠好，病葉枯死面積大，雖實驗過程盡量選取病健交界出，但是活菌數(shù)少；另外，基于全班只有少數(shù)幾個人做成功，我認為可能位于采集地的病原菌處于不良環(huán)境或進入菌落生長的衰亡期，活菌數(shù)本身就不多；最后可能我們采取病樣的地方太單一，病樣葉均采自同一畝田。其菌落形態(tài)見圖2-2（引自第四組）。菌落大小中等，白色透明，背光難以看清，需置于深色背景以便觀察。菌落以接種葉樣為中心，自葉脈向外兩側(cè)呈放射狀生長。

水稻白葉枯病病原為細菌，分離時采取劃線稀釋分離法。所有分離培養(yǎng)均成功，并取得了較好的單個菌落（見圖2-3,2-4）。水稻白葉枯病菌菌落較小，呈圓形，金黃色，半透明，表面光滑，向上隆突。

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圖2-1

圖2-2（引自第四組吳瀚嶸）

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圖2-3

圖2-411

實驗三植物病原真菌玻片標本制作

一實驗目的

觀察植物病原物的形態(tài)，進行病原物的分類鑒定，研究受病組織結構病變、受病植物組織與病原物的解剖學關系以及病原物的保存?zhèn)溆玫�，都需將材料制成適當?shù)娘@微玻片標本。因此，徒手制片技術也是植物病理學研究的重要手段之一。通過本次實驗系統(tǒng)學習常用的徒手制片技術，為普通植物病理學和農(nóng)業(yè)植物病理學的深入學習以及以后開展病理學的有關研究工作奠定堅實的制片技術基礎。

二內(nèi)容、材料和方法

實驗材料：美人蕉銹病病葉、竹子黑痣病病葉

實驗器材：解剖針、剪刀、載玻片、蓋玻片、無菌水

三實驗步驟

（一）美人蕉銹病病原裝片制作

1取美人蕉銹病病葉，用剃刀或解剖針輕輕掛取美人蕉葉背的黃色銹突，使銹突刮破并使刀片或針尖沾上黃色粉狀物。

2在載玻片上點一滴無菌水，將針尖或刀片浸于水中，使銹粉進入漂散于水滴中。重復以上操作，待獲得足夠銹粉后，蓋上蓋玻片。3顯微鏡下觀察。

4鑒別結束后，將載玻片取走，風干水分后，滴一滴綿藍乳酚油，蓋上蓋玻片，貼上標簽。（二）竹子黑痣病病原裝片制作。

1取竹子黑痣病病葉，選取帶黑色突起較多的部位為切面，用刀片切取0.5*1cm規(guī)格的薄片。

2切得所需薄片后，置于滴有無菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片。用鈍物輕輕壓平，置于顯微鏡下觀察。

3鑒別結束后，將載玻片取走，風干水分后，滴一滴綿藍乳酚油，蓋上蓋玻片，貼上標簽。

四實驗結果

如圖3-1

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圖3-1

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實驗四線蟲病害標本的采集、分離與鑒定

一實驗目的

熟悉植物病原線蟲的基本形態(tài)及其所致病害的癥狀特點，

學習土壤線蟲的采集和分離，以及鑒定主要植物病原線蟲的方法。常見線蟲種類的觀察

二內(nèi)容、材料和方法

塑料袋，鐵鏟，貝曼漏斗，解剖鏡，顯微鏡，培養(yǎng)皿，酒精燈，解剖針等

三實驗步驟

1，采樣線蟲多在植物生長高峰期，多數(shù)為夏末秋初。豐富于根系土壤。采時運用五點法，以植株為中心，取其根系五點取樣。取離地表10~20厘米深的土樣。每點取500~1000克，五點取后混勻，再倒出一些，最后取1000克。2，分離（貝曼漏斗法）

分離時在漏斗內(nèi)放大小適中的金屬網(wǎng)，篩上鋪紙巾，漏斗下面接橡皮管，橡皮管下接離心管，加樣本于網(wǎng)的紙巾上，以水淹沒后經(jīng)之。

3，鑒定經(jīng)過四個小時左右，取下離心管，再靜置十分鐘，吸去一半，把剩下的一半倒進培養(yǎng)皿，因為線蟲多數(shù)沉淀了。把培養(yǎng)皿置于解剖鏡下觀察，把線蟲吸到玻片用低倍鏡觀察。4，殺滅治理把線蟲置于酒精燈火焰上灼燒30~60秒，線蟲即死亡。

四實驗結果

觀察到較多無口針的腐生性線蟲和少量的有口針的植物線蟲，推測表明根部土壤附近含有大量線蟲。在解剖鏡下線蟲游動或卷曲，并沉淀，死后即伸直。觀察到標本滑刃線蟲，墊刃線蟲，螺旋線蟲，紐帶線蟲，腐生性線蟲。

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實驗五植物病毒（香蕉束頂病毒）檢測

一實驗目的

由于病毒甚為微小，在普通顯微鏡下看不到，也不能在一般培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所以通常只能靠病狀的表現(xiàn)及病毒的屬性，進行診斷和鑒定。在某些植物的病組織中，在一定時間內(nèi)，尚能發(fā)生特殊的內(nèi)含體，也可作為鑒定上的參考。本實驗的目的是識別植物病毒病的病狀類型及其特點，了解病毒的一般性質(zhì)，學習病毒病害的鑒定方法及其原理。

二實驗步驟

（一）CTAB法提取香蕉葉片總DNA

1、2%CTAB抽提緩沖液，用前加0.2~1%巰基乙醇）在65℃水浴鍋中預熱。2、取供試植物幼葉0.2g，置于研缽中加液氮研磨成粉末狀。

3、在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時迅速加入600μL預熱的抽提緩沖液，稍作

研磨混勻

4、研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，65℃水浴30~45min,期間不時搖勻。5、加入300μL飽和酚，300μL氯仿/異戊醇（24：1），劇烈振蕩2~3min,1200r/min，5min離心（室溫）

6、取上清液置于新的離心管中。加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），溫和的混勻，1200r/min，5min離心（室溫）

7、取上清液置于新的離心管中。加入1/10體積3mol/LNaAc(pH5.2)和2倍體積冷無水乙醇，混勻，置于-20℃冰箱20min或過夜。8、4℃下1201*r/min，10min離心

9、棄上清液，沉淀分別用70%乙醇和無水乙醇各洗一次，室溫下風干，溶于200μLTE或雙蒸水中，DNA制劑在4℃、-20℃、-70℃保存。

（二）PCR檢測

1、PCR管編號

2、配制反應體系，設置陽性對照和陰性對照（共3個反應體系），配制如下：

DEPC水10×PCRBufferdNTPMix1個反映體系16.8μL2.5μL0.5μLn個反映體系n×16.8μLn×2.5μLn×0.5μL15

上游引物F下游引物RrTaq3、加DNA模板4、蓋緊PCR管，放入PCR儀，按所示程序進行擴增

1μL1μL0.2μLn×1μLn×1μLn×0.2μL

（三）PCR反應產(chǎn)物的電泳

1、1.2％瓊脂糖凝膠配制

稱取1.2g瓊脂糖，溶于100mL0.5XTBE電泳工作液中，放入微波爐加熱熔化，室溫下冷卻至50℃左右，每配制100mL瓊脂糖加入5LEB替代物，混勻。

瓊脂糖凝膠緩慢倒入制膠槽內(nèi)，至膠厚約5mm，插上樣品梳，待其繼續(xù)冷卻至固體，拔去樣品梳。2、上樣

往電泳槽倒入0.5×TBE電極緩沖液（液面必須浸沒凝膠上表面）將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中（由負極向正極電泳）用微量移液器吸取6LPCR產(chǎn)物與1L6Xloadingbuffer混合后，加入到凝膠上樣孔中，每樣品一個樣孔，并設分子量標準樣孔。3、電泳及結果觀察

將電泳槽與電泳儀相連接，接通電源（注意樣品孔須位于負極）

5V/cm電泳20～30min。電泳結束后，關閉電源，將制膠板從電泳槽中取出。取出膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)或紫外光燈下觀察、照相。

三實驗結果

本組實驗失敗了。紫外光燈下觀察瓊脂糖凝膠，可見本組試樣除了Marker顯色外，DNA樣品、陽性、陰性均無顯色。

其他組的結果則為，第二組第一樣品顯色，陽性沒顯色，但樣品條帶位置與五六組的陽性相符，說明香蕉束頂病毒DNA提取成功。五六組只有陽性顯色，第四組與本組結果一樣。

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分析結果，可能有以下原因?qū)е聦嶒炇�敗�?/p>

1、實驗原材料所帶此病毒較少。

2、葉片磨得不夠細，病毒DNA并未完全暴露或暴露較少。

3、加液氮研磨葉片時動作較慢，未及時加入抽提緩沖液（已加入巰基乙醇），導致解凍后內(nèi)源

性Dnase降解基因組DNA。

4、CTAB法提取香蕉葉片總DNA過程第9步中，用70%乙醇和無水乙醇洗滌DNA沉淀后未完全風

干即轉(zhuǎn)入低溫冷藏并用于PCR反應，較高濃度乙醇使rTaq活性減弱，PCR反應受阻。5、PCR中添加樣品與對照時溶液不均勻?qū)е虏�沒吸取到所需DNA。

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四實習心得和體會

在我看來，兩個星期的植物病理學實習，對于我們來說，是一次洗禮，是一次轉(zhuǎn)折。得益于學院安排給我們植保專業(yè)的脫課實習，我們跳出了課堂，擺脫了枯燥無味的書本，獲得了在大自然這個大課室中學習的機會。在這次長達兩個星期的實習中，我獲益良多，有知識的增長、技能的提高，有意志的鍛煉、耐心的考驗、更有對我們心思縝密度的挑戰(zhàn)、邏輯。但最讓我覺得重要的是，我意識到了兩樣品質(zhì)對的一個科研人員的重要性：嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度和團體合作精神。

1外出實習，多知覺的學習眼看，手觸，耳聽日本的川島隆太教授認為，包含多種知覺信息的集合對人腦刺激是最大的。為什么人們喜歡看3D電影？因為糅合了聲光效果的信息媒體會讓我們記得更深，腦波頻振動更大！以前上課，一節(jié)課的幻燈片下來，我們記下了多少頁？但實習結束后，至少我還記得玉米葉子上的銹突握在手里的感覺。不下田，某些城市來的同學甚至不知道辣椒長啥樣，雖然在樹上看過。而在田間聽老師講病理生理學、病害流行學、分類學知識似乎好玩得多。2實驗技能扎實提升

兩個星期的實驗，使我們的實驗技能有了長足提升。在某些方面的知識，比如說田間病樣采集的常識還有土壤線蟲的采樣與分離方法等，在之前近乎為零。分離純培養(yǎng)的實驗操作則是功課重溫，使我們的這些技能更扎實。3意志、耐性、細膩

每一天的外出和每一天的實驗都是對我們意志的考驗，采樣的路不可能永遠都是好走的，實驗不可能永遠都是易做易成功的。讓我記憶猶新的是竹子黑痣病切片制作的艱辛。整整一個下午了，我們都糾結在一塊小小的竹葉上。人道讀萬卷書，走萬里路，我們都是切了一萬個切片了，就是鮮有成功。那是對人注意力、小腦平衡力的挑戰(zhàn)，大抵是我做實驗以來做使人眼酸手累的活兒了。但是過幾天當我再次撿起刀片的時候，解剖鏡下我的手似乎沒有那么抖了。

4團結，就是力量

我們可以一個人做好一個實驗，但不可能寫好一篇文章，哪位科學家敢敢說自己從來不看參考的文獻？人的思維是有死角的，對于一位科研人員來說，心思必須盡量縝密，做事和計劃要力圖巨細無遺，但對于一個人來說，要求其做到完美無錯似乎是對他吹毛求疵。因而，思想的交流是我們成功的必經(jīng)之途。團隊協(xié)作的重要性，是我在資料整理、PPT制作以及寫這篇總結報告中感受最深的一樣東西。某個實驗失敗了，為什么失敗，哪一點遺漏了呢，你為什么認為是這個原因呢：實驗數(shù)據(jù)不足了，結果與分析寫不出來了，可以讓我看看你們組的嗎，可以引用一下你們組的圖片嗎，你的分析有點道理哦……有了伙伴，我們不需要一個人對著一大堆數(shù)據(jù)糾結了，我們不需要一個人完成一個80頁的PPT了，我們不需要為自己1個小時都切不到合適的切片供觀察而煩惱，總會有人相機里有相應的照片，總會有人這個實驗步驟中這個藥劑的用途，總會……如果你認為我們會有抄襲之嫌那就錯了。我們厭惡自己的智力勞動成果被竊取，誰也不喜歡自己熬費苦心想出來的分析被人簡單的一個粘貼就拿走了……總而言之，teamwork是如此之重要，我們會發(fā)揚下去！

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六、問題和建議

1希望能增加做實驗或?qū)嵙暤臅r間。農(nóng)業(yè)植物病理學是一門理論與實踐聯(lián)系很強的學科，離開田間搞研究只不過是紙上談兵。好比學一門外語，學好一門外語、最好的方法就是使用它。

2本次實習安排得不甚嚴謹。比如說需要無菌操作的地方?jīng)]用提供無菌操作臺，又比如發(fā)給學生的實習指導上未必全有都與實際操作相符的信息。誠然，迫于經(jīng)費和和時間、空間的原因，我們不能做到像諸位老師真正搞科研時的實驗條件。但是，實驗既要求，又鍛煉科研人員嚴謹、認真、細膩的治學態(tài)度。若實驗本身就漏洞百出，豈不是與培養(yǎng)學生具有嚴謹?shù)目蒲袘B(tài)度、治學精神的初衷相違嗎？為什么有些同學上了大學后覺得大學不外如是，為什么有些同學四年后覺得自己沒學到應該學到的東西呢？為什么老師總是不滿學生素質(zhì)和知識不足呢？有自身興趣、學習態(tài)度等方面的原因，是否也有教學方式和動機不符的惡性循環(huán)的原因呢？

3嘗試大膽些，讓學生們完全支配一個實驗。為什么我們都認為美國的大學好？因為美國的本科教育極力抵制專業(yè)知識的抗拒，而是重視技能的培養(yǎng)，他們會讓學生完全計劃和進行一個科研項目，從立項、儀器的準備，用品用量的計算和安排，到實驗的執(zhí)行、數(shù)據(jù)的處理等等，讓學生全權包辦。不放心學生的實驗技能？害怕學生搞砸了浪費經(jīng)費？那是因為沒有讓學生肩負過責任，大綱為我們做，原理為我們找，材料為我們安排好，我們只需要遵循實驗指導做就可以了，我們有時甚至不需不知道做每一步的原因是什么。迫于教學資源分配和設施、計劃的時限等等原因，我們不能做到世界一流大學的水平，但是否有一些除了硬件以外的地方我們可以做得比他們好呢？

一點拙見，望老師笑涵。

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七、參考文獻

賴傳雅等.201*.農(nóng)業(yè)植物病理學華南本第二版.北京:科學出版社陳利鋒等.201*.農(nóng)業(yè)植物病理學第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社

趙亞華.201*.生物化學與分子生物學實驗技術教程.北京：高等教育出版社許志剛.201*.普通植物病理學.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社徐文耀.201*.賀運春.201*.

普通植物病理學實驗指導北京：科學出版社，植物病害制片技術北京：中國農(nóng)業(yè)出版社

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