選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》知識(shí)點(diǎn)歸納

選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》知識(shí)點(diǎn)歸納

實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

1.微生物是指結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物，有細(xì)胞壁（肽聚糖）、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，無(wú)成型的細(xì)胞核，只有一環(huán)狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色處理，細(xì)菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類(lèi)，區(qū)別在細(xì)胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性（細(xì)胞壁薄，有莢膜）、兼性厭氧的腸道桿菌。

2.細(xì)菌的分離方法有兩種：劃線分離法和涂布分離法。是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。劃線分離就是用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線的過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少，。劃線最后，可使細(xì)菌間的距離加大。將接種后的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10～20小時(shí)后，一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞就會(huì)繁殖成許多細(xì)菌細(xì)胞，形成菌落，不會(huì)重疊。在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是有一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。用于基因工程的大腸桿菌的工程菌，可以用劃線分離法獲得產(chǎn)物表達(dá)能力高的菌株。由于工程菌的質(zhì)粒中通常有抗性基因（如抗氨芐青霉素基因），如在培養(yǎng)基中加入一定量的氨芐青霉素，由于非工程菌的其他雜菌都沒(méi)有抗性基因，所以在劃線后只有存在抗性基因的工程菌能生存下來(lái)。

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涂布分離時(shí)，需要先將培養(yǎng)的菌液稀釋?zhuān)�通常稀釋�?0～10之間，然后去0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认�，可產(chǎn)生相互分開(kāi)的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿中有20個(gè)以?xún)?nèi)的單菌落為最合適。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜。

3.在培養(yǎng)微生物時(shí)，必須進(jìn)行無(wú)菌操作。其首要條件是各種器皿必須是無(wú)菌的，各種培養(yǎng)基也必須是無(wú)菌的，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基、倒平板、接種、平板劃線、平板稀釋涂布等操作中的每一步都要做到無(wú)菌（防止雜菌污染）。進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，要將培養(yǎng)皿倒置，是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴后，落入培養(yǎng)基的表面并且擴(kuò)散，菌落中的細(xì)菌也會(huì)隨水?dāng)U散，菌落見(jiàn)相互影響，很難在分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。4.細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)要用LB液體培養(yǎng)基（通用培養(yǎng)基、常用于做生理學(xué)研究和發(fā)酵工業(yè)），劃線分離要用LB固體培養(yǎng)基（常用于微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存）�！凹�(xì)菌喜葷，霉菌喜素”，通常細(xì)菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來(lái)配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無(wú)機(jī)物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但其基本成分都一樣（五類(lèi)）。

人及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類(lèi)；植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類(lèi)；

微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及生長(zhǎng)因子等五類(lèi)。4.無(wú)菌技術(shù)（1）獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵，要注意以下幾個(gè)方面：①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。

②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。

③為避免周?chē)�環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)�的物品相接觸。

（2）消毒與滅菌的區(qū)別

消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢

和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，還有化學(xué)藥劑

（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紅外線消毒。滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。5.培養(yǎng)基

（1）培養(yǎng)基可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基（按照物理性質(zhì)）。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見(jiàn)的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。

（2）各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽四種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。滿足微生物生長(zhǎng)還需要適宜的pH、氧氣的要求（根據(jù)微生物的需求提供有氧或無(wú)氧環(huán)境）、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。

碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無(wú)機(jī)碳源；糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

-氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3、蛋白質(zhì)、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。（3）培養(yǎng)基配制的原則：目的要明確、PH值要適宜、營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)和要經(jīng)濟(jì)節(jié)約。

實(shí)驗(yàn)4果汁中的果膠和果膠酶

1.果膠是植物細(xì)胞壁的以及胞間層的主要成分之一，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯組成。下面是果膠的結(jié)構(gòu)式：

山楂的果實(shí)中果膠含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是由于果膠的作用。果膠起著將植物細(xì)胞粘合在一起的作用，去掉果膠，就會(huì)使植物組織變得松散。果膠不溶于乙醇，這是鑒別果膠的一種簡(jiǎn)易方法。

2.果膠是植物細(xì)胞壁和胞間層的主要組成成分之一。在果汁加工中，果膠的存在易導(dǎo)致果汁出汁率低，果汁渾濁。果膠酶分解果膠的作用是：①瓦解植物的細(xì)胞壁及胞間層，使榨取果汁更容易；②把果膠分解為可溶性的半乳糖醛酸，使渾濁的果汁變得澄清，因此可以解決果汁加工中出現(xiàn)的問(wèn)題。果膠酶是一類(lèi)酶的總稱(chēng)，包括：多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶和果膠酯酶。在植物細(xì)胞工程中果膠酶的作用是與纖維素酶一起除去植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。

實(shí)驗(yàn)5加酶洗衣粉的使用條件和效果

1.洗衣粉主要成分：表面活性劑，水軟化劑，堿劑，漂白劑等成分，有的洗衣粉中還含有增白劑，香精和色素，以及填充劑等。

2.加酶洗衣粉是指含有酶制劑的洗衣粉,目前常用的酶制劑有四類(lèi)：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶。其中應(yīng)用最廣泛、效果最明顯的是堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。

3.（堿性）蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)水解成可溶于水的小分子肽和氨基酸。

酶酶蛋白質(zhì)多肽氨基酸

脂肪酶的作用是將大分子的脂肪水解為小分子的物質(zhì)，甘油和脂肪酸。

酶脂肪甘油+脂肪酸

4.影響酶活性的因素有溫度、酸堿度和表面活性劑。此外，加酶洗衣粉也不宜長(zhǎng)期存放，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶活力損失。5.實(shí)驗(yàn)操作

課題名稱(chēng)：溫度對(duì)加酶洗衣粉洗滌效果的影響。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕容^不同溫度下加酶洗衣粉的洗滌效果。

實(shí)驗(yàn)原理：酶的催化活性受溫度影響，在適宜溫度下酶的催化活性最高，溫度過(guò)低或過(guò)高酶的催化能力降低。實(shí)驗(yàn)材料：加酶洗衣粉、天平、白色棉布、1000mL燒杯、玻棒、溫度計(jì)、滴管、新鮮雞血、水浴缸、溫度分別為5℃、15℃、25℃、35℃的清水。

實(shí)驗(yàn)步驟：（1）取10cm×10cm的白色棉布4塊，用滴管各滴加5滴新鮮雞血，晾干備用。（2）取1000mL燒杯4個(gè)，用天平分別稱(chēng)取0.5g加酶洗衣粉，依次倒入4個(gè)燒杯中。

（3）將5℃、15℃、25℃、35℃清水各500mL依次倒入4個(gè)燒杯中，用玻棒攪拌溶化洗衣粉。（4）取水浴缸4個(gè)，依次倒入5000mL5℃、15℃、25℃、35℃清水，插入溫度計(jì)保持恒溫。（5）將4個(gè)燒杯分別放到相同水溫的水浴缸中，將帶雞血的棉布分別放到燒杯中浸泡20min。（6）按相同方式用不同玻棒攪拌棉布各，放到水浴缸中。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：

不同種類(lèi)的洗衣粉對(duì)同一污漬或不同污漬洗滌效果的列表比較污染物蛋白酶洗衣粉復(fù)合酶洗衣粉普通洗衣粉油漬血漬奶漬果汁漬6.常見(jiàn)問(wèn)題解答

①為什么洗滌前先將衣物浸于加有適量洗衣粉的水內(nèi)數(shù)小時(shí)？如何縮短衣物的浸泡時(shí)間？是為了使洗衣粉中的蛋白酶充分的分解衣物中的蛋白質(zhì)污漬；用溫水浸泡衣物，因?yàn)槊傅拇呋�作用需要適宜的溫度。②為什么不能在60℃以上的水中使用此洗衣粉？

使用加酶洗衣粉時(shí)，必須注意洗滌用水的溫度，溫度過(guò)高會(huì)使酶變性失活。在低溫下酶的活性下降。③試解釋為什么此洗衣粉不能用于絲質(zhì)及羊毛衣料？

因?yàn)榈鞍酌改苁沟鞍踪|(zhì)水解，而絲質(zhì)及羊毛衣料中含有蛋白質(zhì)，這樣會(huì)損壞衣物。④為什么使用加酶洗衣粉洗衣后，須徹底清洗雙手？

人體皮膚細(xì)胞有蛋白質(zhì)，如不徹底清洗雙手，就會(huì)使手的皮膚受到腐蝕。而使人患過(guò)敏性皮炎、濕疹等，因此，應(yīng)避免與這類(lèi)洗衣粉長(zhǎng)時(shí)間地接觸。

⑤脂肪酶對(duì)沾有礦物油的棉布是否起作用?

不起作用。脂肪酶只對(duì)羥基和羧基形成的酯鍵起作用，而礦物油多為飽和鏈烴，沒(méi)有酯鍵。

實(shí)驗(yàn)7α-淀粉酶的固定化及淀粉水解

1.酶的生產(chǎn)

①提取法：采用一定的技術(shù)直接從動(dòng)植物或微生物的組織、細(xì)胞中將酶提取出來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，在動(dòng)植物或微生物資源豐富的地區(qū)具有應(yīng)用價(jià)值。缺點(diǎn)：要有充足的原材料，廣泛應(yīng)用受到限制。②發(fā)酵法（常用方法）：通過(guò)微生物發(fā)酵獲得所需要的酶。優(yōu)點(diǎn)：易培養(yǎng)、繁殖速度快、便于大規(guī)模生產(chǎn)。2.酶制劑的優(yōu)點(diǎn)：催化效率高、低能耗、低污染等。

酶制劑的缺點(diǎn)：通常對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后會(huì)混在產(chǎn)物中(難分離），可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。

3.固定化酶：固定化酶技術(shù)。即將酶固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)（如固定在不溶于水的載體上）。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：使酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離；固定在載體上的沒(méi)可以被反復(fù)利用。4.固定化酶方法：吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)偶連法等。

5.實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)是用吸附法將a-淀粉酶固定在石英砂上，一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過(guò)固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測(cè)試，流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊精生成。

設(shè)備及用品：5ml塑料注射器、50ml燒杯、滴管、自行車(chē)用氣門(mén)心及夾子、注射器架、試管及微量離心管3支。材料：①α-淀粉酶的固定化:在燒杯中將5mgα-淀粉酶溶于4ml蒸餾水中.由于酶不純,可能有些不溶物。再加入5g石英砂,不時(shí)攪拌,30min后裝入1支下端接有氣門(mén)心并用夾子封住的注射器中(石英砂體積約4ml)。用10倍體積的蒸餾水洗滌此注射器以除去未吸附的游離淀粉酶,流速為1ml/min。②可溶性淀粉溶液:取50ml可溶性淀粉溶于100ml熱水中,攪拌均勻。

③5mmol/LKI-I2溶液：稱(chēng)取0.127g碘和0.83g碘化鉀。加蒸餾水100ml完全溶解后裝入滴瓶中。步驟：①將灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以0.3ml/min的流速過(guò)柱。在流出5ml后接收0.5ml流出液,加入1～2滴KI-I2溶液,觀察顏色.用水稀釋1倍后再觀察顏色。

②實(shí)驗(yàn)后,用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱,放置在4℃冰箱中,幾天后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),看是否有相同的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)反思：

如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀粉酶?可在試管中加入1ml可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯藍(lán)色，則流出液中沒(méi)有淀粉酶了。

實(shí)驗(yàn)8果酒及果醋的制作

（一）實(shí)驗(yàn)原理

1．酵母菌的細(xì)胞呼吸

酶酵母菌進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖，反應(yīng)式：C6H12O6+O2CO2+H2O+能量

酶酵母菌進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精和二氧化碳，表達(dá)式為：C6H12O6C2H5OH+CO2+能量2．酵母菌發(fā)酵的最佳環(huán)境

酵母菌在有氧和無(wú)氧的條件下都能生活：在有氧時(shí)，酵母菌大量繁殖，但是不起到發(fā)酵效果；在無(wú)氧時(shí)，繁殖速度減慢，但是此時(shí)可以進(jìn)行發(fā)酵。在利用酵母菌發(fā)酵時(shí)最好是先通入足夠的無(wú)菌空氣在有氧環(huán)境下一段時(shí)間使其繁殖，再隔絕氧氣進(jìn)行發(fā)酵。20℃左右最適合酵母菌繁殖，酒精發(fā)酵的最佳溫度是在18℃～25℃，pH最好是弱酸性。

3．醋酸菌好氧性細(xì)菌，當(dāng)缺少糖源時(shí)和有氧條件下，可將乙醇（酒精）氧化成醋酸。表達(dá)式為：C2H5OH

CH3COOH+H酶2O；當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生長(zhǎng)的最佳溫度是在30℃～35℃(二)實(shí)驗(yàn)步驟

挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒（→醋酸發(fā)酵→果醋）

1.對(duì)發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機(jī)、盛葡萄汁的器皿等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行清洗并消毒。先用溫水反復(fù)沖洗幾次,再用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。

2.取葡萄500g，去除枝梗和腐爛的子粒。

3.用清水沖洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反復(fù)多次沖洗。

4.用榨汁機(jī)榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中或?qū)⑵咸汛虺蓾{后，用潔凈的紗布過(guò)濾至發(fā)酵瓶中，蓋好瓶蓋。如果沒(méi)有合適的發(fā)酵裝置，可以用500mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超過(guò)塑料瓶總體積的2/3。5.將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵。酵母菌，18℃～25℃，10～12d；醋酸菌，30℃～35℃，7～8d。

6.由于發(fā)酵旺盛期CO2的產(chǎn)量非常大，因此需要及時(shí)排氣，防止發(fā)酵瓶爆裂。如果使用簡(jiǎn)易的發(fā)酵裝置，如瓶子（最好選用塑料瓶），每天要擰松瓶蓋2～4次，進(jìn)行排氣。

7.10d以后，可以開(kāi)始進(jìn)行取樣檢驗(yàn)工作。例如，可以檢驗(yàn)酒味、酒精的含量、進(jìn)行酵母菌的鏡檢等工作。

8.當(dāng)果酒制成以后，可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后將裝置轉(zhuǎn)移至30～35℃的條件下發(fā)酵，適時(shí)向發(fā)酵液中充氣。如果找不到醋酸菌菌種或醋曲，可嘗試自然接種，但效果不是很好。如果沒(méi)有充氣裝置，可以將瓶蓋打開(kāi)，在瓶口蓋上紗布，以減少空氣中塵土等的污染。(三)注意事項(xiàng)

請(qǐng)分析此裝置中的充氣口、排氣口和出料口分別有哪些作用。為什么排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接？結(jié)合果酒、果醋的制作原理，你認(rèn)為應(yīng)該如何使用這個(gè)發(fā)酵裝置？答：充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時(shí)用來(lái)排出CO2的；出料口是用來(lái)取樣的。排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。使用該裝置制酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時(shí)，應(yīng)將充氣口連接氣泵，輸入氧氣。（四）知識(shí)重點(diǎn)

1.釀酒和制醋有關(guān)的微生物分別是酵母菌（真菌）和醋桿菌（細(xì)菌）。制作酒和醋的過(guò)程：在糯米或大米與酒曲混勻后，放在溫度較高的地方，米先變甜，即生成了糖，這是由于黑曲霉或黑根霉的淀粉酶將淀粉水解成糖。甜度增加后，再放到溫度低的地方保持厭氧條件，酵母就開(kāi)始工作，使糖變成酒（糖酵解）。如果時(shí)間太長(zhǎng)，在有氧條件下，醋酸菌就開(kāi)始作用，將乙醇氧化成乙酸，也就是變酸生成醋。

2.用葡萄制作葡萄酒時(shí)，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本實(shí)驗(yàn)為了加速反應(yīng)，使觀察更直觀，需要有更多底物參加反應(yīng)，所以加入酵母使酒精發(fā)酵占有優(yōu)勢(shì)。使用高錳酸鉀溶液浸泡葡萄的目的是為了防止雜菌污染，也是消滅了野生酵母。發(fā)酵瓶中的液體不能裝滿是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中氣體產(chǎn)生，如果裝滿會(huì)使液體外溢，導(dǎo)致發(fā)酵液損失和瓶口等處污染雜菌，影響產(chǎn)物品質(zhì)。用裝著水的彎曲玻璃管可以防止氧氣進(jìn)入，發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳可以出去，還可以防止空氣中雜菌的污染。

3.制醋有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，本實(shí)驗(yàn)屬于固定化菌體連續(xù)發(fā)酵工藝。制醋時(shí)要向發(fā)酵瓶中通入空氣，保證發(fā)酵是一個(gè)氧化過(guò)程，要用棉花過(guò)濾是防止空氣中的微生物進(jìn)入。

實(shí)驗(yàn)10泡菜的腌制和亞硝酸的測(cè)定

1.泡菜腌制過(guò)程中起作用的主要是假絲酵母和乳酸菌。這類(lèi)食品含有乳酸和豐富的維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，但蛋白質(zhì)含量低，還含有一定量的亞硝酸鹽。所用原料是白菜、洋白菜等。在無(wú)氧的條件（由所用容器的凹槽加水在加蓋造成）下，微生物利用菜中的糖和其他營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵，乳酸菌將糖分轉(zhuǎn)化為乳酸，這是需氧菌被殺死；當(dāng)有機(jī)酸增加到一定程度時(shí)，乳酸菌被殺死，出現(xiàn)酵母和霉菌，并逐漸產(chǎn)生亞硝酸。加白酒的作用是可抑制雜菌的生長(zhǎng)，也是一種調(diào)味劑，增加醇香感。加鹽不要太多，否則會(huì)使乳酸菌發(fā)酵遲緩。溫度高則發(fā)酵快，但口味差些。

2.雜菌較少的原因是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸球菌肽對(duì)許多

革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌作用，蛋白質(zhì)含量低，白酒的抑制作用等。

3.亞硝酸鹽是對(duì)人體有害，引起中毒，可致癌的物質(zhì)，由假絲酵母產(chǎn)生。可與對(duì)氨基本磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，這一產(chǎn)物再與N1萘基乙二胺偶聯(lián)，形成紫紅色產(chǎn)物，可用光電比色法定量。實(shí)驗(yàn)步驟包括樣品處理、測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線（以亞硝酸鈉質(zhì)量為橫坐標(biāo)以光密度OD值為縱坐標(biāo)）、計(jì)算[亞硝酸鹽含量（mg/kg）X1=通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的亞硝酸鹽質(zhì)量（ug）m2×1000×樣品處理液總體積V1/樣品質(zhì)量m1×測(cè)定樣品液總體積V2×1000）]。

實(shí)驗(yàn)11植物組織培養(yǎng)

（一）植物組織培養(yǎng)的原理與基本過(guò)程1.原理：細(xì)胞全能性。2.基本過(guò)程：外植體

愈傷組織

胚配裝體

新植物體

（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素1、培養(yǎng)基配制要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌

2、外植體的選�。荷�長(zhǎng)旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化3、消毒4、接種5、培養(yǎng)6、移栽和栽培（三）影響花藥培養(yǎng)的因素

選取適宜的材料和培養(yǎng)基組成是花粉植株誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。最適宜的花藥發(fā)育時(shí)期會(huì)因植物種類(lèi)和品種的不同而不同，但對(duì)大多數(shù)植物而言，適宜進(jìn)行花藥培養(yǎng)的時(shí)期是單核居中期或單核靠邊期。（四）實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)

①植物組織培養(yǎng)不同于扦插、分根、葉插等常規(guī)無(wú)性繁殖。由于植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，所以對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長(zhǎng)，如一些細(xì)菌、真菌等的生長(zhǎng)。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。

②無(wú)菌技術(shù)包括培養(yǎng)基消毒滅菌和植物材料（外植體）的消毒滅菌。對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行表面滅菌時(shí)，一方面要考慮藥劑的消毒效果；另一方面還要考慮植物材料的耐受能力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對(duì)待。③對(duì)接種操作中污染情況的分析：接種3～4d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會(huì)表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。一般情況下，細(xì)菌污染可能是由接種人員造成的，如未戴口罩，接種時(shí)說(shuō)話，或手及器械消毒不嚴(yán)等。真菌污染可能是植物材料滅菌不當(dāng)。

④妥善處理被污染的培養(yǎng)物：操作后常出現(xiàn)培養(yǎng)物被污染的情況。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)材料被污染，特別是真菌性污染，一定不要打開(kāi)培養(yǎng)瓶。應(yīng)先將所有被污染的培養(yǎng)瓶統(tǒng)一放在高壓蒸汽鍋內(nèi)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后再打開(kāi)培養(yǎng)瓶，進(jìn)行清洗。

⑤有毒藥品的處理：外植體滅菌用過(guò)的有毒藥品要妥善處理（如氯化汞等），以免引起環(huán)境污染。（五）知識(shí)重點(diǎn)

1.植物無(wú)性生殖的方法有扦插、嫁接和組織培養(yǎng)等。植物組織培養(yǎng)有兩種形式：愈傷組織培養(yǎng)（固體培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基）和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（液體培養(yǎng)基）。植物組織培養(yǎng)的原理是細(xì)胞的全能性。植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用在快速繁殖、除去植物病毒、新品種的培育（誘變育種、花藥或花粉的單倍體培育、細(xì)胞融合、基因工程等）、品種資源的保護(hù)、某些代謝產(chǎn)物（如色素、芳香物質(zhì)等）的生產(chǎn)等方面。植物組織培養(yǎng)的過(guò)程包括脫分化和再分化。

2.培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)時(shí)植物組織或器官賴(lài)以生長(zhǎng)和發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)條件。包括植物需要的大量元素、微量元素、有機(jī)成分、激素和瓊脂。培養(yǎng)基中通常加一定量的蔗糖是除作為營(yíng)養(yǎng)成分外，還用于維持一定的滲透壓。細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的摩爾濃度比決定組織是生根還是生芽，當(dāng)兩者比例高時(shí)（細(xì)胞分裂素＞生長(zhǎng)素），誘導(dǎo)芽的生成；兩者大致相等時(shí)（細(xì)胞分裂素=生長(zhǎng)素），愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)而不分化；兩者比例低時(shí)（細(xì)胞分裂素＜生長(zhǎng)素），誘導(dǎo)根的形成。但實(shí)驗(yàn)中不用天然激素而是用人工合成的激素（如奈乙酸NAA、6芐基氨基腺嘌呤BA等）是因?yàn)橹参镏写嬖谙鄳?yīng)的分解天然激素的酶而沒(méi)有人工合成激素的相應(yīng)的酶，所以天然激素在植物體內(nèi)作用和存在的時(shí)間短，人工合成激素的作用和存在的時(shí)間長(zhǎng)，作用效果明顯。最常用的MS培養(yǎng)基（生芽培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基）。配制過(guò)程包括稱(chēng)量、溶解、調(diào)PH、融化、分裝（三角瓶）、加蓋滅菌等步驟。3.MS培養(yǎng)基與微生物培養(yǎng)基的比較

微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主，而MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必須的大量元素和微量元素兩大類(lèi)。MS培養(yǎng)基中微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無(wú)機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時(shí)能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。

4.植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無(wú)菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時(shí)期適宜的花蕾；花藥裂開(kāi)后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時(shí)更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)該在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)外植體愈傷組織叢狀苗生根苗移栽植株。需要一定的光照和溫度的條件。

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選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》知識(shí)點(diǎn)歸納

實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

1.微生物是指結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物，有細(xì)胞壁（肽聚糖）、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，無(wú)成型的細(xì)胞核，只有一環(huán)狀DNA分子（擬核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌（革蘭氏染液染色后，再脫色處理，細(xì)菌仍保留染色液的顏色）和革蘭氏陰性菌兩大類(lèi)，區(qū)別在細(xì)胞壁的成分不同。大腸桿菌是革蘭氏陰性（細(xì)胞壁薄，有莢膜）、兼性厭氧的腸道桿菌。

2.細(xì)菌的分離方法有兩種：劃線分離法和涂布分離法。是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。劃線分離就是用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線的過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少，。劃線最后，可使細(xì)菌間的距離加大。將接種后的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10～20小時(shí)后，一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞就會(huì)繁殖成許多細(xì)菌細(xì)胞，形成菌落，不會(huì)重疊。在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是有一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。用于基因工程的大腸桿菌的工程菌，可以用劃線分離法獲得產(chǎn)物表達(dá)能力高的菌株。由于工程菌的質(zhì)粒中通常有抗性基因（如抗氨芐青霉素基因），如在培養(yǎng)基中加入一定量的氨芐青霉素，由于非工程菌的其他雜菌都沒(méi)有抗性基因，所以在劃線后只有存在抗性基因的工程菌能生存下來(lái)。

-5-7

涂布分離時(shí)，需要先將培養(yǎng)的菌液稀釋?zhuān)�通常稀釋�?0～10之間，然后去0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认�，可產(chǎn)生相互分開(kāi)的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿中有20個(gè)以?xún)?nèi)的單菌落為最合適。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。

劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開(kāi)，但操作復(fù)雜。

3.在培養(yǎng)微生物時(shí)，必須進(jìn)行無(wú)菌操作。其首要條件是各種器皿必須是無(wú)菌的，各種培養(yǎng)基也必須是無(wú)菌的，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基、倒平板、接種、平板劃線、平板稀釋涂布等操作中的每一步都要做到無(wú)菌（防止雜菌污染）。進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，要將培養(yǎng)皿倒置，是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴后，落入培養(yǎng)基的表面并且擴(kuò)散，菌落中的細(xì)菌也會(huì)隨水?dāng)U散，菌落見(jiàn)相互影響，很難在分成單菌落，達(dá)不到分離的目的。

4.細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)要用LB液體培養(yǎng)基（通用培養(yǎng)基、常用于做生理學(xué)研究和發(fā)酵工業(yè)），劃線分離要用LB固體培養(yǎng)基（常用于微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存）�！凹�(xì)菌喜葷，霉菌喜素”，通常細(xì)菌培養(yǎng)基要用蛋白胨和酵母提取物來(lái)配制，還要加入一定的氯化鈉，以維持一定的滲透壓；霉菌培養(yǎng)基一般用無(wú)機(jī)物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但其基本成分都一樣（五類(lèi)）。

人及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類(lèi)；植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類(lèi)；微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及生長(zhǎng)因子等五類(lèi)。4.無(wú)菌技術(shù)（1）獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵，要注意以下幾個(gè)方面：①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。

②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。

③為避免周?chē)�環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒

精燈火焰附近進(jìn)行。

④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)�的物品相接觸。（2）消毒與滅菌的區(qū)別

消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，還有化學(xué)藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紅外線消毒。滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。5.培養(yǎng)基（1）培養(yǎng)基可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基（按照物理性質(zhì)）。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見(jiàn)的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。

（2）各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽四種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。滿足微生物生長(zhǎng)還需要適宜的pH、氧氣的要求（根據(jù)微生物的需求提供有氧或無(wú)氧環(huán)境）、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。

碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無(wú)機(jī)碳源；糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

-氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3、蛋白質(zhì)、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。

（3）培養(yǎng)基配制的原則：目的要明確、PH值要適宜、營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)和要經(jīng)濟(jì)節(jié)約。

實(shí)驗(yàn)4果汁中的果膠和果膠酶

1.果膠是植物細(xì)胞壁的以及胞間層的主要成分之一，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯組成。下面是果膠的結(jié)構(gòu)式：

山楂的果實(shí)中果膠含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是由于果膠的作用。果膠起著將植物細(xì)胞粘合在一起的作用，去掉果膠，就會(huì)使植物組織變得松散。果膠不溶于乙醇，這是鑒別果膠的一種簡(jiǎn)易方法。

2.果膠是植物細(xì)胞壁和胞間層的主要組成成分之一。在果汁加工中，果膠的存在易導(dǎo)致果汁出汁率低，果汁渾濁。果膠酶分解果膠的作用是：①瓦解植物的細(xì)胞壁及胞間層，使榨取果汁更容易；②把果膠分解為可溶性的半乳糖醛酸，使渾濁的果汁變得澄清，因此可以解決果汁加工中出現(xiàn)的問(wèn)題。果膠酶是一類(lèi)酶的總稱(chēng)，包括：多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶和果膠酯酶。在植物細(xì)胞工程中果膠酶的作用是與纖維素酶一起除去植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。

實(shí)驗(yàn)5加酶洗衣粉的使用條件和效果

1.洗衣粉主要成分：表面活性劑，水軟化劑，堿劑，漂白劑等成分，有的洗衣粉中還含有增白劑，香精和色素，以及填充劑等。

2.加酶洗衣粉是指含有酶制劑的洗衣粉,目前常用的酶制劑有四類(lèi)：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶。其中應(yīng)用最廣泛、效果最明顯的是堿性蛋白酶和堿性脂肪酶。3.（堿性）蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)水解成可溶于水的小分子肽和氨基酸。

酶酶蛋白質(zhì)多肽氨基酸

脂肪酶的作用是將大分子的脂肪水解為小分子的物質(zhì)，甘油和脂肪酸。

酶脂肪甘油+脂肪酸

4.影響酶活性的因素有溫度、酸堿度和表面活性劑。此外，加酶洗衣粉也不宜長(zhǎng)期存放，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致酶活力損失。5.實(shí)驗(yàn)操作

課題名稱(chēng)：溫度對(duì)加酶洗衣粉洗滌效果的影響。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕容^不同溫度下加酶洗衣粉的洗滌效果。

實(shí)驗(yàn)原理：酶的催化活性受溫度影響，在適宜溫度下酶的催化活性最高，溫度過(guò)低或過(guò)高酶的催化能力降低。

實(shí)驗(yàn)材料：加酶洗衣粉、天平、白色棉布、1000mL燒杯、玻棒、溫度計(jì)、滴管、新鮮雞血、水浴缸、溫度分別為5℃、15℃、25℃、35℃的清水。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）取10cm×10cm的白色棉布4塊，用滴管各滴加5滴新鮮雞血，晾干備用。（2）取1000mL燒杯4個(gè)，用天平分別稱(chēng)取0.5g加酶洗衣粉，依次倒入4個(gè)燒杯中。

（3）將5℃、15℃、25℃、35℃清水各500mL依次倒入4個(gè)燒杯中，用玻棒攪拌溶化洗衣粉。（4）取水浴缸4個(gè)，依次倒入5000mL5℃、15℃、25℃、35℃清水，插入溫度計(jì)保持恒溫。（5）將4個(gè)燒杯分別放到相同水溫的水浴缸中，將帶雞血的棉布分別放到燒杯中浸泡20min。（6）按相同方式用不同玻棒攪拌棉布各，放到水浴缸中。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)：

不同種類(lèi)的洗衣粉對(duì)同一污漬或不同污漬洗滌效果的列表比較污染物油漬血漬奶漬果汁漬蛋白酶洗衣粉復(fù)合酶洗衣粉普通洗衣粉6.常見(jiàn)問(wèn)題解答

①為什么洗滌前先將衣物浸于加有適量洗衣粉的水內(nèi)數(shù)小時(shí)？如何縮短衣物的浸泡時(shí)間？是為了使洗衣粉中的蛋白酶充分的分解衣物中的蛋白質(zhì)污漬；用溫水浸泡衣物，因?yàn)槊傅拇呋�作用需要適宜的溫度。

②為什么不能在60℃以上的水中使用此洗衣粉？使用加酶洗衣粉時(shí)，必須注意洗滌用水的溫度，溫度過(guò)高會(huì)使酶變性失活。在低溫下酶的活性下降。③試解釋為什么此洗衣粉不能用于絲質(zhì)及羊毛衣料？

因?yàn)榈鞍酌改苁沟鞍踪|(zhì)水解，而絲質(zhì)及羊毛衣料中含有蛋白質(zhì)，這樣會(huì)損壞衣物。④為什么使用加酶洗衣粉洗衣后，須徹底清洗雙手？人體皮膚細(xì)胞有蛋白質(zhì)，如不徹底清洗雙手，就會(huì)使手的皮膚受到腐蝕。而使人患過(guò)敏性皮炎、濕疹等，因此，應(yīng)避免與這類(lèi)洗衣粉長(zhǎng)時(shí)間地接觸。⑤脂肪酶對(duì)沾有礦物油的棉布是否起作用?

不起作用。脂肪酶只對(duì)羥基和羧基形成的酯鍵起作用，而礦物油多為飽和鏈烴，沒(méi)有酯鍵。

實(shí)驗(yàn)7α-淀粉酶的固定化及淀粉水解

1.酶的生產(chǎn)

①提取法：采用一定的技術(shù)直接從動(dòng)植物或微生物的組織、細(xì)胞中將酶提取出來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，在動(dòng)植物或微生物資源豐富的地區(qū)具有應(yīng)用價(jià)值。缺點(diǎn)：要有充足的原材料，廣泛應(yīng)用受到限制。②發(fā)酵法（常用方法）：通過(guò)微生物發(fā)酵獲得所需要的酶。優(yōu)點(diǎn)：易培養(yǎng)、繁殖速度快、便于大規(guī)模生產(chǎn)。

2.酶制劑的優(yōu)點(diǎn)：催化效率高、低能耗、低污染等。

酶制劑的缺點(diǎn)：通常對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產(chǎn)成本；反應(yīng)后會(huì)混在產(chǎn)物中(難分離），可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。3.固定化酶：固定化酶技術(shù)。即將酶固定在一定空間內(nèi)的技術(shù)（如固定在不溶于水的載體上）。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：使酶既能與反應(yīng)物接觸，又能與產(chǎn)物分離；固定在載體上的沒(méi)可以被反復(fù)利用。4.固定化酶方法：吸附法、交聯(lián)法、包埋法、共價(jià)偶連法等。

5.實(shí)驗(yàn)操作

實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)是用吸附法將a-淀粉酶固定在石英砂上，一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過(guò)固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測(cè)試，流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊精生成。

設(shè)備及用品：5ml塑料注射器、50ml燒杯、滴管、自行車(chē)用氣門(mén)心及夾子、注射器架、試管及微量離心管3支。

材料：①α-淀粉酶的固定化:在燒杯中將5mgα-淀粉酶溶于4ml蒸餾水中.由于酶不純,可能有些不溶物。再加入5g石英砂,不時(shí)攪拌,30min后裝入1支下端接有氣門(mén)心并用夾子封住的注射器中(石英砂體積約4ml)。用10倍體積的蒸餾水洗滌此注射器以除去未吸附的游離淀粉酶,流速為1ml/min。

②可溶性淀粉溶液:取50ml可溶性淀粉溶于100ml熱水中,攪拌均勻。

③5mmol/LKI-I2溶液：稱(chēng)取0.127g碘和0.83g碘化鉀。加蒸餾水100ml完全溶解后裝入滴瓶中。

步驟：①將灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以0.3ml/min的流速過(guò)柱。在流出5ml后接收0.5ml流出液,加入1～2滴KI-I2溶液,觀察顏色.用水稀釋1倍后再觀察顏色。

②實(shí)驗(yàn)后,用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱,放置在4℃冰箱中,幾天后再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),看是否有相同的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)反思：

如何證明洗滌固定化酶柱的流出液中沒(méi)有淀粉酶?

可在試管中加入1ml可溶性淀粉，再加幾滴淀粉酶柱流出液，保溫幾分鐘后用碘液檢驗(yàn)。如仍顯藍(lán)色，則流出液中沒(méi)有淀粉酶了。

實(shí)驗(yàn)8果酒及果醋的制作

（一）實(shí)驗(yàn)原理

1．酵母菌的細(xì)胞呼吸

酶酵母菌進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖，反應(yīng)式：C6H12O6+O2CO2+H2O+能量

酶酵母菌進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精和二氧化碳，表達(dá)式為：C6H12O6C2H5OH+CO2+能量2．酵母菌發(fā)酵的最佳環(huán)境

酵母菌在有氧和無(wú)氧的條件下都能生活：在有氧時(shí)，酵母菌大量繁殖，但是不起到發(fā)酵效果；在無(wú)氧時(shí)，繁殖速度減慢，但是此時(shí)可以進(jìn)行發(fā)酵。在利用酵母菌發(fā)酵時(shí)最好是先通入足夠的無(wú)菌空氣在有氧環(huán)境下一段時(shí)間使其繁殖，再隔絕氧氣進(jìn)行發(fā)酵。20℃左右最適合酵母菌繁殖，酒精發(fā)酵的最佳溫度是在18℃～25℃，pH最好是弱酸性。

3．醋酸菌好氧性細(xì)菌，當(dāng)缺少糖源時(shí)和有氧條件下，可將乙醇（酒精）氧化成醋酸。表達(dá)式為：

酶C2H5OHCH3COOH+H2O；當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生長(zhǎng)的最佳溫度是在30℃～35℃(二)實(shí)驗(yàn)步驟

挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒（→醋酸發(fā)酵→果醋）1.對(duì)發(fā)酵瓶、紗布、榨汁機(jī)、盛葡萄汁的器皿等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行清洗并消毒。先用溫水反復(fù)沖洗幾次,再用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。2.取葡萄500g，去除枝梗和腐爛的子粒。

3.用清水沖洗葡萄1～2遍除去污物，注意不要反復(fù)多次沖洗。

4.用榨汁機(jī)榨取葡萄汁后，將其裝入發(fā)酵瓶中或?qū)⑵咸汛虺蓾{后，用潔凈的紗布過(guò)濾至發(fā)酵瓶中，蓋好瓶蓋。如果沒(méi)有合適的發(fā)酵裝置，可以用500mL的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超過(guò)塑料瓶總體積的2/3。

5.將發(fā)酵瓶置于適宜的溫度下發(fā)酵。酵母菌，18℃～25℃，10～12d；醋酸菌，30℃～35℃，7～8d。6.由于發(fā)酵旺盛期CO2的產(chǎn)量非常大，因此需要及時(shí)排氣，防止發(fā)酵瓶爆裂。如果使用簡(jiǎn)易的發(fā)酵裝置，如瓶子（最好選用塑料瓶），每天要擰松瓶蓋2～4次，進(jìn)行排氣。

7.10d以后，可以開(kāi)始進(jìn)行取樣檢驗(yàn)工作。例如，可以檢驗(yàn)酒味、酒精的含量、進(jìn)行酵母菌的鏡檢等工作。

8.當(dāng)果酒制成以后，可以在發(fā)酵液中加入醋酸菌或醋曲，然后將裝置轉(zhuǎn)移至30～35℃的條件下發(fā)酵，適時(shí)向發(fā)酵液中充氣。如果找不到醋酸菌菌種或醋曲，可嘗試自然接種，但效果不是很好。如果沒(méi)有充氣裝置，可以將瓶蓋打開(kāi)，在瓶口蓋上紗布，以減少空氣中塵土等的污染。(三)注意事項(xiàng)

請(qǐng)分析此裝置中的充氣口、排氣口和出料口分別有哪些作用。為什么排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接？結(jié)合果酒、果醋的制作原理，你認(rèn)為應(yīng)該如何使用這個(gè)發(fā)酵裝置？

答：充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣用的；排氣口是在酒精

發(fā)酵時(shí)用來(lái)排出CO2的；出料口是用來(lái)取樣的。排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。使用該裝置制酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時(shí)，應(yīng)將充氣口連接氣泵，輸入氧氣。（四）知識(shí)重點(diǎn)

1.釀酒和制醋有關(guān)的微生物分別是酵母菌（真菌）和醋桿菌（細(xì)菌）。制作酒和醋的過(guò)程：在糯米或大米與酒曲混勻后，放在溫度較高的地方，米先變甜，即生成了糖，這是由于黑曲霉或黑根霉的淀粉酶將淀粉水解成糖。甜度增加后，再放到溫度低的地方保持厭氧條件，酵母就開(kāi)始工作，使糖變成酒（糖酵解）。如果時(shí)間太長(zhǎng)，在有氧條件下，醋酸菌就開(kāi)始作用，將乙醇氧化成乙酸，也就是變酸生成醋。

2.用葡萄制作葡萄酒時(shí)，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本實(shí)驗(yàn)為了加速反應(yīng)，使觀察更直觀，需要有更多底物參加反應(yīng)，所以加入酵母使酒精發(fā)酵占有優(yōu)勢(shì)。使用高錳酸鉀溶液浸泡葡萄的目的是為了防止雜菌污染，也是消滅了野生酵母。發(fā)酵瓶中的液體不能裝滿是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中氣體產(chǎn)生，如果裝滿會(huì)使液體外溢，導(dǎo)致發(fā)酵液損失和瓶口等處污染雜菌，影響產(chǎn)物品質(zhì)。用裝著水的彎曲玻璃管可以防止氧氣進(jìn)入，發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳可以出去，還可以防止空氣中雜菌的污染。3.制醋有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，本實(shí)驗(yàn)屬于固定化菌體連續(xù)發(fā)酵工藝。制醋時(shí)要向發(fā)酵瓶中通入空氣，保證發(fā)酵是一個(gè)氧化過(guò)程，要用棉花過(guò)濾是防止空氣中的微生物進(jìn)入。

實(shí)驗(yàn)10泡菜的腌制和亞硝酸的測(cè)定

1.泡菜腌制過(guò)程中起作用的主要是假絲酵母和乳酸菌。這類(lèi)食品含有乳酸和豐富的維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，但蛋白質(zhì)含量低，還含有一定量的亞硝酸鹽。所用原料是白菜、洋白菜等。在無(wú)氧的條件（由所用容器的凹槽加水在加蓋造成）下，微生物利用菜中的糖和其他營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵，乳酸菌將糖分轉(zhuǎn)化為乳酸，這是需氧菌被殺死；當(dāng)有機(jī)酸增加到一定程度時(shí)，乳酸菌被殺死，出現(xiàn)酵母和霉菌，并逐漸產(chǎn)生亞硝酸。加白酒的作用是可抑制雜菌的生長(zhǎng)，也是一種調(diào)味劑，增加醇香感。加鹽不要太多，否則會(huì)使乳酸菌發(fā)酵遲緩。溫度高則發(fā)酵快，但口味差些。

2.雜菌較少的原因是乳酸菌產(chǎn)生的乳酸球菌肽對(duì)許

多革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌作用，蛋白質(zhì)含量低，白酒的抑制作用等。

3.亞硝酸鹽是對(duì)人體有害，引起中毒，可致癌的物質(zhì)，由假絲酵母產(chǎn)生�？膳c對(duì)氨基本磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，這一產(chǎn)物再與N1萘基乙二胺偶聯(lián)，形成紫紅色產(chǎn)物，可用光電比色法定量。實(shí)驗(yàn)步驟包括樣品處理、測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線（以亞硝酸鈉質(zhì)量為橫坐標(biāo)以光密度OD值為縱坐標(biāo)）、計(jì)算[亞硝酸鹽含量（mg/kg）X1=通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的亞硝酸鹽質(zhì)量（ug）m2×1000×樣品處理液總體積V1/樣品質(zhì)量m1×測(cè)定樣品液總體積V2×1000）]。

實(shí)驗(yàn)11植物組織培養(yǎng)

（一）植物組織培養(yǎng)的原理與基本過(guò)程1.原理：細(xì)胞全能性。2.基本過(guò)程：外植體

愈傷組織

胚配裝體

新植物體

（二）影響植物組織培養(yǎng)的因素1、培養(yǎng)基配制要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌

2、外植體的選�。荷�長(zhǎng)旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化3、消毒4、接種5、培養(yǎng)6、移栽和栽培（三）影響花藥培養(yǎng)的因素

選取適宜的材料和培養(yǎng)基組成是花粉植株誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵。最適宜的花藥發(fā)育時(shí)期會(huì)因植物種類(lèi)和品種的不同而不同，但對(duì)大多數(shù)植物而言，適宜進(jìn)行花藥培養(yǎng)的時(shí)期是單核居中期或單核靠邊期。（四）實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)

①植物組織培養(yǎng)不同于扦插、分根、葉插等常規(guī)無(wú)性繁殖。由于植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，所以對(duì)培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長(zhǎng)，如一些細(xì)菌、真菌等的生長(zhǎng)。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前功盡棄，因此要進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作。

②無(wú)菌技術(shù)包括培養(yǎng)基消毒滅菌和植物材料（外植體）的消毒滅菌。對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行表面滅菌時(shí)，一方面要考慮藥劑的消毒效果；另一方面還要考慮植物材料的耐受能力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對(duì)待。

③對(duì)接種操作中污染情況的分析：接種3～4d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會(huì)表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。一般情況下，細(xì)菌污染可能是由接種人員造成的，如未戴口罩，接種時(shí)說(shuō)話，或手及器械消毒不嚴(yán)等。真菌污染可能是植物材料滅菌不當(dāng)。

④妥善處理被污染的培養(yǎng)物：操作后常出現(xiàn)培養(yǎng)物被污染的情況。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)材料被污染，特別是真菌性污染，一定不要打開(kāi)培養(yǎng)瓶。應(yīng)先將所有被污染的培養(yǎng)瓶統(tǒng)一放在高壓蒸汽鍋內(nèi)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后再打開(kāi)培養(yǎng)瓶，進(jìn)行清洗。

⑤有毒藥品的處理：外植體滅菌用過(guò)的有毒藥品要妥善處理（如氯化汞等），以免引起環(huán)境污染。（五）知識(shí)重點(diǎn)

1.植物無(wú)性生殖的方法有扦插、嫁接和組織培養(yǎng)等。植物組織培養(yǎng)有兩種形式：愈傷組織培養(yǎng)（固體培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基）和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（液體培養(yǎng)基）。植物組織培養(yǎng)的原理是細(xì)胞的全能性。植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用在快速繁殖、除去植物病毒、新品種的培育（誘變育種、花藥或花粉的單倍體培育、細(xì)胞融合、基因工程等）、品種資源的保護(hù)、某些代謝產(chǎn)物（如色素、芳香物質(zhì)等）的生產(chǎn)等方面。植物組織培養(yǎng)的過(guò)程包括脫分化和再分化。

2.培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)時(shí)植物組織或器官賴(lài)以生長(zhǎng)和發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)條件。包括植物需要的大量元素、微量元素、有機(jī)成分、激素和瓊脂。培養(yǎng)基中通常加一定量的蔗糖是除作為營(yíng)養(yǎng)成分外，還用于維持一定的滲透壓。細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素的摩爾濃度比決定組織是生根還是生芽，當(dāng)兩者比例高時(shí)（細(xì)胞分裂素＞生長(zhǎng)素），誘導(dǎo)芽的生成；兩者大致相等時(shí)（細(xì)胞分裂素=生長(zhǎng)素），愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)而不分化；兩者比例低時(shí)（細(xì)胞分裂素＜生長(zhǎng)素），誘導(dǎo)根的形成。但實(shí)驗(yàn)中不用天然激素而是用人工合成的激素（如奈乙酸NAA、6芐基氨基腺嘌呤BA等）是因?yàn)橹参镏写嬖谙鄳?yīng)的分解天然激素的酶而沒(méi)有人工合成激素的相應(yīng)的酶，所以天然激素在植物體內(nèi)作用和存在的時(shí)間短，人工合成激素的作用和存在的時(shí)間長(zhǎng)，作用效果明顯。最常用的MS培養(yǎng)基（生芽培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基）。配制過(guò)程包括稱(chēng)量、溶解、調(diào)PH、融化、分裝（三角瓶）、加蓋滅菌等步驟。3.MS培養(yǎng)基與微生物培養(yǎng)基的比較

微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主，而MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必須的大量元素和微量元素兩大類(lèi)。MS培養(yǎng)基中微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無(wú)機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時(shí)能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。

4.植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無(wú)菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時(shí)期適宜的花蕾；花藥裂開(kāi)后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時(shí)更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)該在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)外植體愈傷組織叢狀苗生根苗移栽植株。需要一定的光照和溫度的條件。

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