細胞生物學實驗總結(jié)

細胞自主實驗方法總結(jié)

自主實驗是在老師的指導和幫助下學生自己設計實驗且自己準備實驗所需的一切準備工作來完成的實驗。平時做實驗老師占重要地位但自主實驗中學生占重要地位。自主實驗中學生自己思考設計出實驗方案，實驗所需試劑，實驗方法和步驟然后按該方案來做實驗。

老師讓學生做自主實驗的原因是老師想培養(yǎng)學生的動手能力，合作能力，想讓學生獨立思考，想讓學生親自動手做實驗，最重要的一點是把理論知識結(jié)合實踐。

細胞培養(yǎng)是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生存和生長的技術(shù)為細胞培養(yǎng)技術(shù)。

本實驗采用了微量全血培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)人體外周血小淋巴細胞,使原處于G0期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞,進而進行有絲分裂，增殖成功率高、技術(shù)方法完善。把體外增殖的小淋巴細胞裂解,對細胞核染色體進行染色和固定,制得人染色體標本,用于進行染色體組型分析，取得了令人滿意的效果。

人和動物細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的一項基本技術(shù)。目前,動物細胞培養(yǎng)主要用于通過大量的細胞培養(yǎng)獲得有經(jīng)濟價值的生物產(chǎn)品和細胞本身。1966年以前基本上用Moorhead等，1960年建立的人外周血白細胞培養(yǎng)技術(shù),該方法比較完善,成功率高。但缺點是取血量多,手續(xù)較麻煩。近30多年來國內(nèi)外絕大多數(shù)均采用微量全血培養(yǎng)技術(shù),不但取血量少,而且可略去一些繁瑣操作過程,如離心、分離血漿等,做起來既方便,也節(jié)省人力和物力,比較適于推廣和使用。

本實驗對實驗操作要求比較高。實驗進行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%酒精擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。操作做成中也要保證不污染。

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第三章

細胞生物學研究方法

METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49

從整個生命科學的發(fā)展趨勢看細胞生物學研究分子水平細胞水平結(jié)構(gòu)功能細胞生命活動分析綜合

整個生命科學的發(fā)展最終是要解釋生命的活動規(guī)律，而生命的活動規(guī)律要到細胞中去尋找。而要了解細胞的活動規(guī)律，我們要在分子水平細胞內(nèi)各種生物分子的代謝規(guī)律，這就需要研究細胞內(nèi)的各種組分

另外我們還要了解細胞的結(jié)構(gòu)和功能，2

由于課時所限，我們不可能所有的方法都詳細講解。3

Mainpoint

第一節(jié)顯微技術(shù)(細胞的形態(tài)學觀察技術(shù)）一、光學顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)細胞分離技術(shù)

第三節(jié)生物化學與分子生物學技術(shù)第四節(jié)細胞培養(yǎng)與細胞雜交本章重點：

1.掌握細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法（主要是光學顯微鏡、電子顯微鏡）；2.掌握細胞培養(yǎng)、細胞工程的基本技術(shù)；3.了解細胞組分的分析方法。第一節(jié)顯微技術(shù)

工具是人類器官的延伸。顯微鏡300多年的改進是從器具和觀察對象兩方面著手提高放大倍數(shù)和增加分辨細微結(jié)構(gòu)的能力。

在器具上，包括選擇投射于物體上的波束的性質(zhì)及為便于觀察而不斷改善操縱裝置；在觀察對象上，則是如何突顯待觀察的部分。波束有光波和電磁波，

光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。第一節(jié)顯微技術(shù)

、光學顯微鏡(TheLightMicroscopy)（一）普通光學顯微鏡駱駝刺根尖染色體

對二氯苯飽和溶液處理9

光學顯微鏡是如何作到這一點的?（一）普通光學顯微鏡可變光闌管鏡目鏡

2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。放大率（magnification）:最終成像的大小與原物體大小的比值;分辨率/力（Resolution）：分辨或區(qū)分兩質(zhì)點間最小距離。（一）普通光學顯微鏡

3.分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。D=0.61λ/Nsinθ

其中λ為入射光線波長；N=介質(zhì)折射率；

Nsinθ＝鏡口率(低倍鏡0.28，高倍鏡0.65，油鏡1.25.

2θ=鏡口角(樣品對物鏡鏡口的張角);

通常2θ最大值可達140度，空氣N＝1，D約0.3um。

油鏡N＝1.5，此時分辨率D可達0.2um，思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？12

表一、幾種介質(zhì)的折射率（二）相差顯微鏡

Figure3-2.Interferencebetweenlightwaves.Whentwolightwavescombineinphase,theamplitudeoftheresultantwaveislargerandthebrightnessisincreased.Twolightwavesthatareoutofphasepartiallycanceleachotherandproduceawavewhoseamplitude,andthereforebrightness,isdecreased.A+/B+

相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

1.A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。

2.B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。（二）相差顯微鏡基本原理：

利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把光程差變成振幅差(即明暗)。從而提高各種結(jié)構(gòu)間的對比度，明者更明，暗者更暗，立體感增強，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。故樣品不需染色，適合觀察活細胞。（二）相差顯微鏡

與普通光學顯微鏡相比有兩個特殊之處：相位板

環(huán)形光闌（位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。

使用時，環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來。

用途：可觀察未經(jīng)染色的玻片標本，活細胞動態(tài)，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。（三）微分干涉差顯微鏡（DIC）

原理：利用兩組平面偏振光的干涉。光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等，光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺。20

平面偏振光光是一種電磁波,光振動的方向與它前進的方向垂直�；�礎(chǔ)知識

樣品經(jīng)過微分干涉差顯微鏡,厚度上的微小差異就轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加反差，加強影像的明暗效果。

標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。

用途：微分干涉差顯微鏡用于研究活細胞中較大的細胞器，與錄像設備結(jié)合，可觀察活細胞中的顆粒及細胞器的運動。DIC顯微鏡下的硅藻(偽彩色)

(A)普通明視場顯微鏡下的纖維原細胞(B)相差顯微鏡下的纖維原細胞,(C)微分干涉顯微鏡下的纖維原細胞(D)普通暗視場顯微鏡下的纖維原細胞.23

微分干涉差顯微鏡原生動物[阿米巴變形蟲的顯微照片。進行人工上色的三維圖像展示了豐富的細節(jié)。細胞中有些物質(zhì)，如葉綠體等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料（酸性品紅、啶橙，中性紅、甲基綠）或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡不僅對這類物質(zhì)可進行定性、定量和定位研究，還可觀察其形狀及在細胞內(nèi)的變化。

（四）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope

Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen微管呈綠色、微絲紅色、核藍色

還可進行免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。圖像清晰，色彩逼真。

（四）熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點：

1.光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；2.有兩個特殊的濾光片；3.照明方式通常為落射式。27

熒光顯微鏡是在光鏡水平對特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性定位的最有力的工具。免疫熒光技術(shù)

熒光素直接標記技術(shù)

GFP基因與某種蛋白基因融合，可直接觀察該蛋白的動態(tài)變化。28

第一套濾光片為激發(fā)光濾片，裝在光源和樣品之間，只有能激發(fā)熒光染料發(fā)光的特定波長才能通過。

第二套為阻斷濾片，裝在物鏡和目鏡之間，只讓染料所發(fā)出的熒光通過。這樣，在黑暗背景襯托下，很容易觀測到發(fā)出熒光的樣品。beam-splittingmirror（半透射反射鏡）：傾斜的、透明的鏡子，使光垂直地反射到觀察者的眼中。

Figure3-8.Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.熒光素羅丹明

（五）激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM

原理：一束光線通過聚焦成點，在樣品表面掃描后成象。因為在一個時間試樣上只有一個點被照亮。隨著試樣被掃描，像素的積累便構(gòu)成了圖像。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些分層圖像再由計算機重構(gòu)成三維圖像。LCSM的原理：物鏡成像透鏡

共焦點是指物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一小點。它在某一瞬間只用一束通過檢測器前的小孔的光成像，可顯著提高分辨率。可以觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

樣品制備無特殊要求；各種染色、非染色、熒光標記的組織（包括活組織）、培養(yǎng)細胞、粘附細胞、細胞涂片、石蠟切片、冰凍切片。激光共聚焦掃描顯微境特點與用途：特點：

用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。用途：

亞細胞定位及動態(tài)變化。

能掃描不同層次，重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)（立體圖像）�？筛淖冇^察的焦平面，因而能進行“光學切片”，觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。爪蟾黑色素細胞LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管

共聚焦顯微鏡由于可以自動改變觀察的焦平面，因此縱向分辨率得到改善。分辨率越高，意味著可使用的點數(shù)越多，圖像越細致。

受精5天后的卵子，一些精細胞仍粘貼在它表面。胚胎和精細胞核呈紫色，而精子的尾巴是綠色。藍色區(qū)域是縫隙連接，它們把細胞彼此聯(lián)系在一起。果蠅原腸胚表層細胞質(zhì)內(nèi)免疫熒光標記的微絲A.免疫熒光技術(shù)B.LCSM36

GFP標記的鼠神經(jīng)中樞干細胞移入剛出生的小老鼠的腦內(nèi)，已經(jīng)開始形成少突細胞和星細胞。”

Figure3-3.Edgeeffects.Theinterferenceeffectsobservedathighmagnificationwhenlightpassestheedgesofasolidobjectplacedbetweenthelightsourceandtheobserver.（六）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope38

光學上的丁達爾現(xiàn)象（六）暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。

應用：觀察未經(jīng)染色4~200nm的活體或膠體粒子。（核、線粒體），分辨率比普通顯微鏡高50倍。

(a)梅毒螺旋體，暗視野。

(b)團藻屬和水棉屬的綠藻；暗視野。

(c)迂回螺菌具有束狀鞭毛的一種個體很大的細菌。相差。(d)肉毒梭菌，它具有近端生卵形內(nèi)生孢子；相差。

(e)草履蟲染色后觀察到的中央大核和在其邊上的球形小核；相差。abcde

（七）倒置顯微鏡inversemicroscope

物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，物鏡在載物臺之下，照明系統(tǒng)在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用于研究生物大分子之間的距離和相互作用。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的研究方法都要破碎細胞或?qū)�細胞造成損傷，無法做到在活細胞生理條件下實時的對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進行動態(tài)研究。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)技術(shù)的應用結(jié)合基因工程等技術(shù)正好彌補了這一缺陷，該技術(shù)可用于研究活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用。

（八）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）43

（八）熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）

以GFP的兩個突變體CFP、YFP為例簡要說明其原理：

CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當?shù)闹丿B，當它們足夠接近時(10nm范圍內(nèi))，用CFP的吸光激發(fā)，其發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個發(fā)色基團之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對空間位置的改變非常靈敏。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（bYFPaaexemexem

蛋白質(zhì)a與b之間的相互作用46

例如要研究兩種蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP、蛋白質(zhì)b、YFP。用CFP吸收波長433nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設計，使當?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒有發(fā)生相互作用時，CFP與YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是CFP的發(fā)射波長為476nm的熒光；但當?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是YFP的發(fā)射波長為527nm的熒光。將編碼這種融合蛋白的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細胞內(nèi)表達，這樣就可以在活細胞生理條件下研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用。

（九）熒光漂白恢復技術(shù)（FRAP）用途：主要檢測活體細胞表面或細胞內(nèi)部的分子運動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小。

原理：將大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)或脂質(zhì)）耦聯(lián)上親脂性或者親水性的熒光分子（如熒光素或綠色熒光蛋白），采用高能量激光束照射特定的區(qū)域，是該區(qū)域熒光發(fā)生不可逆淬滅，但由于分子運動，其它區(qū)域攜帶熒光的生物大分子會移向淬滅區(qū)，從而恢復熒光漂白�；謴偷臅r間與運動速度有關(guān)。當代顯微鏡的發(fā)展趨勢

采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。自動化與電子化。光鏡標本的制備以石蠟切片為例：

材料處理固定脫水包埋切片染色觀察

染色劑：普通染色劑，熒光染色劑二、電子顯微鏡

（一）透射電子顯微鏡（二）掃描電子顯微鏡1.原理

電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。52

掃描電鏡：20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結(jié)構(gòu)。分辨力為5~10nm。

有效放大倍率為0.2mm/10nm=201*0X

工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。表1、不同光線的波長2.Resolution

肉眼：0.2mm；光學顯微鏡：0.2um；電子顯微鏡，0.2nm分辨力與分辨率并不等同。

2.電鏡的結(jié)構(gòu)：電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)。3.用途：用于觀察超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)，即小于0.2m、光學顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)，又稱亞顯微結(jié)構(gòu)。電子顯微鏡透射電子顯微鏡

TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM

為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。Scanningelectronmicroscope（SEM）表2、電子顯微鏡與光學顯微鏡的比較

光學顯微鏡電子顯微鏡發(fā)光源燈泡電子槍光源可見光、紫外電子束光透鏡玻璃透鏡電磁透鏡真空系統(tǒng)空氣真空成象色彩彩色單色樣品要求無需脫水需脫水成像原理利用樣品對光利用樣品對的吸收形成明電子的散射暗反差和顏色和透射形成變化

明暗反差2、電子顯微鏡用到的一些技術(shù)（1）超薄切片技術(shù)

電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅40-~50nm的超薄切片，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。

這就要求樣品具有一定的剛性和韌性，SpecimenPreparationforElectronMicroscopy

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水。以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，厚度:40-50nm石蠟切片的厚度:3-10um;SectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:復膜顯示出了標本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。主要用來觀察胞質(zhì)中的細胞骨架纖維及其結(jié)合蛋白。培養(yǎng)細胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，網(wǎng)格蛋白衣被

Figure3-22.Three-dimensionalreconstructionfromserialsections.Singlethinsectionssometimesgivemisleadingimpressions.Inthisexamplemostsectionsthroughacellcontainingabranchedmitochondrionwillappeartocontaintwoorthreeseparatemitochondria.Sections4and7,moreover,mightbeinterpretedasshowingamito-chondrionintheprocessofdividing.Thetruethree-dimensionalshape,however,canbereconstructedfromserialsections.（4）電鏡三維重構(gòu)技術(shù)研究生物大分子三維結(jié)構(gòu)：

通過電鏡技術(shù)，從不同側(cè)面，不同層次獲得生物大分子的照片，經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)化，展示生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。

生物大分子三維結(jié)構(gòu)是當今生命科學研究的核心課題之一。（5）低溫電鏡技術(shù)：

近幾年發(fā)展起來的，樣品不固定、不染色、不干燥，直接包埋在100nm的冰膜包埋，電鏡內(nèi)-160℃，用相位襯度成像。展示生物大分子及其復合物表面與內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，具更高分辨率。艾滋病毒

（6）掃描電子顯微鏡SEM

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。

次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。血管破裂，一個個紅血球細胞正在慢慢的從破裂的血管流出酵母第三章

細胞生物學研究方法

METHODSANDTECHNIQUES第二版和第三版P49肺氣泡肺癌細胞74

肺氣泡是血液交換氣體的地方。（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：量子力學的隧道效應，當針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一低電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率很高:橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm。優(yōu)點:三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進行觀察。

STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu掃描隧道顯微鏡不僅僅只用于觀察單個的原子，還可通過顯微鏡的尖端、一些精良的刻度尺和穩(wěn)定的手來操縱單個的原子，如挑選原子或?qū)⑺鼈儚囊贿呁频搅硪贿叀！皰呙杷淼里@微鏡是一次一個人操縱原子的首個最好的工具�！蓖ㄟ^此辦法，成功將12個溴原子通過分子的自我組合排成一個圓圈。三、顯微操作技術(shù)

micromanipulationtechnique

在倒置顯微鏡下利用顯微操作儀進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作儀是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。

顯微操作技術(shù)包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。

細胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學者童第周等上個世紀70年代在魚類細胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。

Thetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation

PreparationandreformofkaryoplastandcytoplastTransgenicanimalsandplantsTransgenicmice10weeks44gand29g

克隆技術(shù)不僅對胚胎學、發(fā)育遺傳學、醫(yī)學有重大意義，而且也有巨大的經(jīng)濟潛力。首先克隆技術(shù)可用于器官移植，造福人類；也可改良物種，給畜牧業(yè)帶來好處。另外，克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，可大批量“復制”含有可產(chǎn)生藥物原料的轉(zhuǎn)基因動物，從而使克隆技術(shù)更好地為人類服務。我國有關(guān)科學家提出應明確禁止克隆技術(shù)應用于人類，否則將產(chǎn)生一系列倫理學、法律學等的災難性問題。電子顯微鏡能否代替光學顯微鏡？電子顯微鏡用電子束代替了光束，大大提高了分辨率，電子顯微鏡相對光學顯微鏡是個飛躍。但是

電子顯微鏡：1.樣品制備更加復雜；2.鏡筒需要真空，成本更高；3.只能觀察“死”的樣品，不能觀察活細胞。光學顯微鏡：1.技術(shù)性能要求不高，使用容易；2.可以觀察活細胞，觀察視野范圍廣，可在組織內(nèi)觀察細胞間的聯(lián)系；3.而且一些新發(fā)展起來的光學顯微鏡能夠觀察特殊的細胞或細胞結(jié)構(gòu)組分。因此，電子顯微鏡不能完全代替光學顯微鏡。第二節(jié)細胞分離技術(shù)

Figure3-31.Afluorescence-activatedcellsorter.當細胞經(jīng)過激光束時，根據(jù)細胞是否帶有熒光，包含有單個細胞的液滴被帶上正或負電荷。接下來這個液滴在電場作用下被收集到試管中。

注意：細胞的濃度必須調(diào)整到絕大多數(shù)液滴都不包含多個細胞，多個細胞的液滴不帶電荷而流入廢液杯中。流式細胞儀一、細胞的分離

二、細胞組分分離技術(shù)

1.Thetechniqueofdifferentialcentrifugation

Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.S=(dx/dt)/2x=110-13sec.密度

Figure3-34.Thepreparativeultracentrifuge.

轉(zhuǎn)速為1~2.5萬rpm的離心機稱為高速離心機。

轉(zhuǎn)速>2.5萬rpm，離心力>8.9萬ｇ，稱為超速離心機。

目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500000g。（一）差速離心Differentialcentrifugation特點：

介質(zhì)密度均一；

速度由低向高，逐級離心。

用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序：核葉綠體線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。

可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。

Figure3-36.Comparisonofmethodsofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation.（二）密度梯度離心

A.速度沉降velocitysedimentationB.等密度沉降isopycnicsedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。

原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。用途：分離密度不等的顆粒。

特點：介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度。所需的力場通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。

Figure3-37.Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.樣品點到層析慮紙的一端并且吹干，包含兩個以上試劑的液滴可通過毛細管作用緩慢移動。樣品中的不同組分移動速率不同。

2.Paperchromatography紙層析法又稱紙色譜法88

將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點位置。

Figure3-38.Theseparationofmoleculesbycolumnchromatography.層析柱有玻璃和塑料柱兩種，內(nèi)填有可滲透的固體基質(zhì)，如纖維素，而且基質(zhì)也被溶劑浸潤。樣品放在柱子的最上端，然后大量的溶劑從上端緩慢流過柱子，樣品中不同的成分的遷移率不同，從而被分開，從柱子下端流入不同的試管。3.Columnchromatography

Figure3-39.Threetypesofmatricesusedforchromatography.離子交換柱(A)是一種帶有電荷的基質(zhì)，它可保留帶有相反電荷的分子，常用來分離蛋白質(zhì)，通常所用基質(zhì)為DEAE-cellulose,帶正電；CM-celluloseandphosphocellulose,帶負電。凝膠過濾柱(B)的基質(zhì)是惰性而多空的。比較小的分子因滲透到基質(zhì)中而移動緩慢，較大的分子則從基質(zhì)分子的空隙中較快的分離出來。親和層析柱(C)的基質(zhì)分子上連接有一個特殊的配體，如抗體或酶基團，這些基團可以與特殊的分子結(jié)合，然后在洗脫下來。

Figure3-41.Thedetergentsodiumdodecylsulfate(SDS)andthereducingagentbeta-mercaptoethanol.ThesetwochemicalsareusedtosolubilizeproteinsforSDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis.TheSDSisshownhereinitsionizedform.4.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis

Figure3-42.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS-PAGE).Electrophoresis

Figure3-44.Separationofproteinmoleculesbyisoelectricfocusing.AtlowpHthecarboxylicacidgroupsofproteinstendtobeuncharged(-COOH)andtheirnitrogen-containingbasicgroupsfullycharged(-NH3+),givingmostproteinsanetpositivecharge.AthighpHthecarboxylicacidgroupsarenegativelycharged(-COO-)andthebasicgroupstendtobeuncharged(-NH2),givingmostproteinsanetnegativecharge.AtitsisoelectricpHaproteinhasnonetchargesincethepositiveandnegativechargesbalance.Thus,whenatubecontainingafixedpHgradientissubjectedtoastrongelectricfieldintheappropriatedirection,eachproteinspeciespresentwillmigrateuntilitformsasharpbandatitsisoelectricpH,asshown.等電點聚焦電泳

Figure3-45.Two-dimensionalpolyacrylamide-gelelectrophoresis.AlltheproteinsinanE.colibacterialcellareseparatedinthisgel,inwhicheachspotcorrespondstoadifferentpolypeptidechain.Notethatdifferentproteinsarepresentinverydifferentamounts.Thebacteriawerefedwithamixtureofradioisotope-labeledaminoacidsandtheresultwasdetectedbyauto-radiography.(CourtesyofPatrickO"Farrell.)第三節(jié)、生物化學與分子生物學技術(shù)一、細胞化學技術(shù)

組織化學或細胞化學染色：是利用染色劑可同細胞的某種成分發(fā)生反應而著色的原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術(shù)。

利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括無機物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。

二、細胞組分的顯示方法DNA的顯示方法:

1.甲基綠和毗羅紅兩種染色劑對DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，毗羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。

2.Schiff反應：Schiff試劑即亞硫酸品紅溶液，HO3S-C-(-C6H5-NH2)3，與細胞中的醛基（DNA或多糖）反應呈現(xiàn)紅色。96

甲基綠和毗羅紅兩種染色劑對DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色，毗羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色。利用甲基綠、毗羅紅混合染色劑將細胞染色，可以顯示DNA和RNA在細胞中的分布。鹽酸能夠改變細胞膜的通透性，加速染色劑進人細胞，同時使染色體中的DNA與蛋白質(zhì)分離，有利于DNA與染色劑結(jié)合。

DNA分子結(jié)構(gòu)中帶有醛基-CHO,用HCl水解可使醛基釋放,再以無色的亞硫酸品紅液(Schiff)染色使醛基與亞硫酸品紅結(jié)合,呈現(xiàn)紫紅色,這是DNA特有的顯色反品紅溶液通入二氧化硫得到的無色物質(zhì),又名希夫（Schiff）試劑,遇醛顯紅色,遇酮不變色,可以區(qū)別醛和酮這是分子HO3S-C-(-C6H5-NH2)RNA被酸水解后降解。97

二、細胞組分的顯示方法蛋白質(zhì)的顯示方法：

用于蛋白質(zhì)的定性和定位。

1.米倫(Millon)反應→顯示酪氨酸的方法蛋白質(zhì)上酪氨酸+氮汞試劑→紅色沉淀2.重氮反應

[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在酸性，低溫下(<5℃)可生成重氮鹽，即四氮鹽。在堿性條件下，四氮鹽與組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環(huán)結(jié)合產(chǎn)生偶聯(lián)反應形成有色復合物。98

四氮化聯(lián)鄰茴香胺法(Tetra-azotized-o-anisidine)[應用]廣泛應用于顯示酶的活性

[原理]芳香伯胺與亞硝酸作用,在低溫下(<5℃)可生成重氮鹽,此即重氮反應.重氮鹽可與酚類作用生成有色化合物偶氮化合物.上述反應必須在酸性條件下進行.本實驗,聯(lián)鄰茴香胺在酸性,低溫條件下與亞硝酸作用生成四氮鹽.四氮鹽有兩個重氮鹽,其中一個重氮基在堿性條件下與所要顯示的組氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯環(huán)結(jié)合產(chǎn)生偶聯(lián)反應,另一個重氮基與酚類或奈類發(fā)生偶聯(lián)反應以增色.因此,可以用生成的偶氮染料來代表組織細胞的蛋白質(zhì)含量.二、細胞組分的顯示方法多糖的顯示方法：

高碘酸雪夫法(PAS法)：

[原理]高碘酸為強氧化劑,它可以氧化多糖分子內(nèi)1,2乙二醇(順式和反式)而產(chǎn)生醛基,此醛基再與Schiff試劑結(jié)合即產(chǎn)生紅紫色。99

中性多糖糖原

碳水化合物酸性多糖硫酸軟骨素A,B,C,肝素,硫酸角(組織中多糖類)質(zhì)素,透明質(zhì)酸等

蛋白多糖粘蛋白,唾酸粘蛋白糖脂腦苷脂類

※組織中糖的種類較多,因此,要特異性地顯示各種糖類必須用抑制和酶水解來對照實驗.二、細胞組分的顯示方法細胞內(nèi)脂類染色：

用易溶于脂類的染料,使之溶于所檢的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂類著色。如：四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應呈黑色，蘇丹Ⅲ與脂滴反應呈深紅色。100

二、細胞組分的顯示方法細胞堿性磷酸酶：底物：甘油磷酸酯反應產(chǎn)物：磷酸根再加入：鉛鹽或鈷鹽

產(chǎn)生：磷酸鉛或磷酸鈷無色沉淀再加入：硫化銨產(chǎn)生：有色沉淀1102

根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。常用的標記物有熒光素和酶。（二）植物細胞培養(yǎng)

外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。

懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點：①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；②便于進行細胞融合，形成雜交細胞；

③適宜條件下可產(chǎn)生細胞壁，經(jīng)誘導分化成完整植株。單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。二、細胞融合

同核體：相同基因型的細胞融合而成。異核體：不同基因型的細胞融合而成。

自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘導劑處理才能融合。

誘導細胞融合的方法：生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。單克隆抗體技術(shù)

正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。單克隆抗體技術(shù)主要作用

用單克隆抗體代替多克隆抗體克服了交叉反應,提高了免疫學實驗的特異性和敏感性,從而促進了醫(yī)學檢驗學的發(fā)展;

用單克隆作親和柱,可分離提純含量極低的可溶性的抗原,如激素,細胞因子和難以純化的腫瘤抗原等，為物質(zhì)提純開辟了一條新途徑；

制備的單克隆抗體識別細胞表面特異性受體,若將抗腫瘤藥物(如毒素或放射性物質(zhì))偶連到其上,構(gòu)建生物導彈,有望攻克人類頑疾--腫瘤。

單克隆抗體有廣闊的發(fā)展前景,但有其局限性。單克隆抗體作為外源性的抗原，多次反復的注射后能促使機體發(fā)生免疫應答,產(chǎn)生相應的抗抗體,產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，因此單克隆抗體應用于臨床有其風險性，在緊急預防的情況下，可以慎用。

總之，單克隆抗體為人類在檢驗疾病、治療疾病方面取得了重大突破,盡管它還有些弊端,相信在不久的將來人類會制備出更加優(yōu)良的單克隆抗體,為攻克腫瘤作出更大的貢獻!第四節(jié)模式生物模式生物的特點有:

1)生理特征能夠代表生物界的某一大類群；2)容易獲得并易于在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖；3)容易進行實驗操作,特別是遺傳學分析。1海膽

最早被使用的模式生物，主要用于早期發(fā)育生物學(受精，早期胚胎發(fā)育)。

1891年，HansDriesh在顯微鏡下把剛剛完成第一次卵裂的海膽胚胎一分為二，發(fā)現(xiàn)分開后的兩個細胞各自形成了一個完整幼蟲，證明了胚胎具有調(diào)整發(fā)育的能力。為現(xiàn)代發(fā)育生物學奠定了第一塊觀念里程碑。2病毒

基因組小，易于遺傳操作，可作為外源基因載體。3細菌大腸桿菌

培養(yǎng)簡單易于操作，繁殖能力強，繁殖時間短等因素，常作為實驗材料，在遺傳學中主要作為遺傳變異的物種，利用其變異來選取更好的材料，用在其他工業(yè)等方面如：發(fā)酵，菌體培養(yǎng)，醫(yī)療藥物的提取等。大腸桿菌的存在，使得試驗易于操作。4酵母釀酒酵母

特點:1)是單細胞生物,可在基本培養(yǎng)基上生長,可通過改變物理或化學環(huán)境完全控制其生長2)在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均可生長,并可在實驗條件下控制單倍體和二倍體之間的相互轉(zhuǎn)換,這對其基因功能的研究十分有利

3)有將近31%編碼蛋白質(zhì)的基因或ORF與哺乳動物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性5線蟲

Caenorhabditiselegans特點：

1)通身透明，長不過1mm。

2)身體中所有細胞能被逐個盤點并各歸其類。幼蟲：556個體細胞，2個原始生殖細胞。

成蟲：雌雄同體成蟲，959個體細胞，201*個生殖細胞。雄性成蟲(偶見)：1031個體細胞，1000個生殖細胞。

3)生命周期短，從生到死僅為三天半，使得不間斷地觀察并追蹤每個細胞的演變成為可能。

4)把線蟲浸泡到含有核酸的溶液中可實現(xiàn)基因?qū)�入�?果蠅

drosophilamelanogaster

主要用于遺傳和發(fā)育研究。

其特點為：繁殖迅速，染色體巨大，易于進行基因定位。

由14個體節(jié)構(gòu)成的軀干完全對稱，一套基因控制了這些體節(jié)從上到下的發(fā)生過程，這套基因普遍存在于從昆蟲到人的基因組中，是決定機體左右對稱布局形成的最基本因素。7斑馬魚斑馬魚特點:

1)產(chǎn)卵多，繁殖迅速。

2)胚胎通體透明，是進行胚胎發(fā)育機理和基因組研究的好材料。8小鼠

17世紀開始用于解剖學和動物實驗，經(jīng)長期人工飼養(yǎng)選擇培育，已育成千余個獨立的遠交群和近交系，是生物醫(yī)學研究中廣泛使用的模式生物，是當今世界上研究最詳盡的哺乳類實驗動物。1999年，美英幾家大型科研機構(gòu)成立了老鼠基因組測序的合作團體，201*年8月公布了老鼠基因組物理圖譜的框架，完整的老鼠基因組圖譜于201*年完成。模式生物小鼠的應用

轉(zhuǎn)基因小鼠與基因剔除小鼠小鼠突變品系與人類疾病研究

帶有人生長激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠（右側(cè)小鼠為轉(zhuǎn)基因小鼠，左側(cè)為正常小鼠）。130

小鼠生理生化和發(fā)育過程和人類相似性，基因組的高度同源性以及的基因組改造技術(shù)的成熟性，均說明利用小鼠建立人類疾病的模型可以真實模擬人類疾病的發(fā)病過程及對藥物的反應。因此，利用小鼠等模式動物建立的人類疾病模型具有重大理論和運用價值。8擬南芥－“植物中的果蠅”Arabidopsisthaliana

擬南芥的基因組是目前已知植物基因組中最小的。每個單倍染色體組（n=5）的總長只有7000萬個堿基對，即只有小麥染色體組長的1/80，這就使克隆它的有關(guān)基因相對說來比較容易。擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。131

擬南芥的優(yōu)點是植株�。�1個茶杯可種植好幾棵）、每代時間短（從發(fā)芽到開花不超過6周）、結(jié)子多（每棵植物可產(chǎn)很多粒種子）、生活力強（用普通培養(yǎng)基就可作人工培養(yǎng)）。模式生物基因組計劃

模式生物基因組計劃是人類基因組計劃的一個重要組成部分，是人類基因組計劃的必要補充并對后者的研究有很大的促進作用。

由于人類對自身理解的限制、實驗的限制和倫理學的制約，醫(yī)學、生物學的研究在很大程度上依賴于對一些模式生物的研究。在研究人類基因組的同時，平行地進行一些微生物、植物、動物等模式生物基因組的研究，不僅可為人類基因組研究做方法學和組織工作的積累，而且通過將從模式生物中所得到的數(shù)據(jù)和資料與人類基因組進行同源性比較，借以闡明人類相應基因的功能。因此，一些與人類基因具有相似性，但結(jié)構(gòu)和基因組成都相對比較簡單的生物體就成為進行人類基因組研究的絕好樣本，即為人類基因組研究提供參照，對這些模式生物的基因組進行測序和分析，就是模式生物基因組計劃。

四．請從下列20種方法（A-T）中，挑選一種最佳方法來探測下面的10個問題

方法A，X射線衍射，B，SOUTHERN雜交，C，掃描電鏡技術(shù)，D，細胞顯微分光光度計E，免疫熒光技術(shù)，F(xiàn)，電鏡超薄切片技術(shù)，G，Northern雜交，H，放射自顯影技術(shù)I，核磁共振技術(shù)J，DNA序列分析，K，原位雜交技術(shù)L，Western雜交技術(shù)Ｍ，核酸電鏡及核酸異源雙鏈分析技術(shù)Ｎ，電鏡負染色技術(shù)Ｏ，細胞融合技術(shù)Ｐ，飽和雜交技術(shù)Q，免疫電鏡技術(shù)R，冷凍蝕刻復型技術(shù)S，顯微液相技術(shù)T，DNA定點突變技術(shù)

問題1粗略估計某種組織的基因組大概有多少的DNA序列正在轉(zhuǎn)錄mRNA2某種抗癌藥物的作用機制是阻止腫瘤細胞的DNA復制還是阻止蛋白質(zhì)合成

3已克隆了雞卵清蛋白的基因，如何證明在雛雞的輸卵管中該基因不轉(zhuǎn)錄而在產(chǎn)卵母雞輸卵管中則活躍地轉(zhuǎn)錄

4已克隆了人的rDNA問rDNA分布在人的哪幾條染色體上

5把分離的線粒體置于電場中，問電場作用是否會使線粒體內(nèi)膜上蛋白質(zhì)分布發(fā)生改變6體外培養(yǎng)細胞，從G1期到S期，細胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

7已提純了某種雙鏈DNA病毒的DNA分子，并克隆了這種病毒的一個基因，問該基因病毒基因組的哪個部位上

8原代細胞長成致密單層，由于接觸抑制作用DNA合成停止，如何證明9觀察腺病毒核衣殼表面的亞單位-衣粒形態(tài)與排列方式

10研究酵母菌在無氧和有氧條件下生長時，其線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

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