細胞生物學研究方法部分總結(jié)

合肥學院

201*屆《細胞生物學》階段性總結(jié)

題目第三章細胞生物學研究方法部分總結(jié)

姓名：崔俏俏專業(yè)：生物工程

班級：12級生物工程（1）班學號：120201*027指導教師：李老師

201*年10月22日

第三章細胞生物學研究方法

學習細胞生物學研究方法，了解實驗原理，掌握基本實驗方法，對于學習

細胞生物學基礎(chǔ)知識，加深對理論學說的理解，以及進行創(chuàng)新性研究，推動本學科和相關(guān)學科的不斷發(fā)展都具有重要的意義。

細胞生物學的研究方法和實驗技術(shù)很多，根據(jù)研究方法的性質(zhì)、特點、應(yīng)用范疇和實驗技術(shù)原理、類型及條件的相關(guān)性和類同性，可以將其主要的研究方法和實驗技術(shù)分為以生物有機體組織細胞結(jié)構(gòu)自然狀態(tài)為主體的形態(tài)學研究方法、細胞化學研究方法和模擬體內(nèi)環(huán)境、以實驗性設(shè)計為特色的綜合性研究方法和分子生物學技術(shù)等。

第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學顯微技術(shù)

根據(jù)光學原理不同，目前光學顯微鏡已發(fā)展成多種類型，教學研究領(lǐng)域中常見的主要有以下幾種：

一．暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡又稱超顯微鏡或限外顯微鏡。它是根據(jù)“丁達爾效應(yīng)”光學原理，設(shè)計出來的一種特殊顯微鏡，比普通光學顯微鏡的分辨率高50倍。它通過暗視野聚光器，把直射光照明變?yōu)樾鄙涔庹彰�，使通過樣品進入物鏡成像的光只有衍射光。所以，整個觀察視野背景是黑暗的，而觀察的樣品在黑暗的背景反襯下顯示出清晰的衍射光結(jié)構(gòu)輪廓。

二．相差顯微鏡

相差顯微鏡能夠把相差變成振幅差，主要依賴于它的特殊結(jié)構(gòu)。首先用環(huán)狀光闌代替可變光闌，環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的，其作用是將直射光所成的像從一些衍射旁緣分出來。其次是用帶相板的相差物鏡代替普通物鏡，相板分為共軛區(qū)和補償區(qū)，可選擇性地鍍上吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜，從而使相板具有既能推遲直射光線或衍射光的相位，又有吸收光調(diào)整亮度、突出疊加效果的作用。

三．熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是能夠利用細胞內(nèi)某些化學成分或細胞經(jīng)特殊染色后，受到特定波長的光激發(fā)后，產(chǎn)生特征性波長的熒光，來檢測細胞內(nèi)某些化學組成的一種儀器。熒光顯微鏡是依靠一個高發(fā)光效率的點光源（高壓汞燈），釋放出含有較多數(shù)量的紫外光和藍紫光的復合光，經(jīng)過濾色系統(tǒng)后，形成激發(fā)光，激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡（石英玻璃制成）的放大進行觀察。

應(yīng)用熒光顯微鏡具有三個優(yōu)點：

敏感性高：只要細胞內(nèi)某種物質(zhì)的含量達到10-16克就能檢測出來。特異性強：特定性質(zhì)的化學物質(zhì)，在一定激發(fā)光的激發(fā)下，產(chǎn)生熒光的光譜性質(zhì)不變。

測定快速：細胞受激發(fā)后，就可進行觀察，5-10分鐘即可獲得對細胞的特定物質(zhì)進行定性、定位研究的結(jié)果。

第二節(jié)細胞培養(yǎng)細胞工程與顯微技術(shù)操作

細胞培養(yǎng)技術(shù)

細胞培養(yǎng)是在無菌條件下，把動、植物組織細胞（微生物細胞），自有機體分離出來放在玻璃器皿內(nèi)，加入人工配制的培養(yǎng)基，使細胞繼續(xù)生存和生長，以直接觀察活細胞的形態(tài)、活動、分化及發(fā)育過程的一種技術(shù)。

細胞培養(yǎng)的突出特點是在離體的條件下觀察和研究細胞生命活動的規(guī)律。根據(jù)研究目的不同，可選用不同的培養(yǎng)方式。觀察細胞形態(tài)變化，可用蓋片微室懸滴培養(yǎng)、平板培養(yǎng)或液體懸浮培養(yǎng)，后用倒置相差顯微鏡進行活體觀察；檢查細胞繁殖速度，用細胞懸浮培養(yǎng)為宜。

動物細胞一般接種于有培養(yǎng)液或半固體培養(yǎng)基的器皿中，于37℃，5％CO2，95％空氣，95％～100％濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。植物細胞或原生質(zhì)體則采用固體、懸滴、液體等多種培養(yǎng)方法，溫度為25～30℃，有時需光照，對液體培養(yǎng)需通風。

細胞的生長需要有充分營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基和適宜的環(huán)境條件。培養(yǎng)基不僅要具備正常機體中可以從外環(huán)境中攝取的必需氨基酸，還要提供一些非必需氨基酸、多種維生素，這是細胞代謝過程中必不可少的成分，而離體的動植物細胞、原生質(zhì)體自身不能合成；培養(yǎng)基中還需含Ca2+、Mg2+等無機離子與緩沖成分，以組成一定離子強度和穩(wěn)定pH（pH7.27.4）的細胞生長條件；還應(yīng)提供適量的葡萄糖，以維持細胞代謝及產(chǎn)能；動物細胞培養(yǎng)時，尚需加入適量的血清，而植物細胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)時，需加入生長素、激動素等植物激素。

目前常見的細胞培養(yǎng)類型主要有：原核生物培養(yǎng)，，動物細胞培養(yǎng)和植物細胞培養(yǎng)。

一．原生物細胞培養(yǎng)

細菌細胞培養(yǎng)簡便，生長繁殖快，不僅能直接利用細菌本身進行污水處理等工業(yè)化生產(chǎn)，而且目前的生物工程技術(shù)中，利用細菌表達一些人工構(gòu)建的基因產(chǎn)物也成了現(xiàn)實，細菌細胞在基因工程研究中發(fā)揮著越來越重大的作用。細菌的培養(yǎng)關(guān)鍵是防止其它菌的污染，它可在液體培養(yǎng)基中生長也可在固體培養(yǎng)基上生長。

二．動物細胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)的動物細胞可分為原代細胞與傳代細胞。原代細胞是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。適應(yīng)在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細胞稱為傳代細胞。

三．植物細胞培養(yǎng)

植物細胞培養(yǎng)主要有單倍體細胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。單倍體細胞培養(yǎng)主要用花藥在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。可以從小孢子（雄性生殖細胞）直接發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者通過愈傷組織誘導分化出芽和根，最終長成植株。單倍體細胞培養(yǎng)已在植物育種中取得了很大成就。

總結(jié)：

對本章部分內(nèi)容做過總結(jié)以后，更有利于我對其知識點

的掌握，對我以后的學習也有很大的幫助。因此，也希望自己在以后的學習過程中能養(yǎng)成一種善于總結(jié)的良好習慣。

擴展閱讀：4細胞生物學研究方法答案

第二章細胞生物學研究方法

一、名詞解釋

1、resolution：分辨力是指顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處，能清楚地分辨被檢物體細微結(jié)構(gòu)最小距離的能力。能夠區(qū)分的兩點間的距離越小，表示分辨力越高。

2、顯微結(jié)構(gòu)：通過光學顯微鏡所觀察到的樣品的各種結(jié)構(gòu)，如細胞的大小、外部形態(tài)以及細胞核、線粒體、高爾基復合體、中心體等內(nèi)部構(gòu)成都屬于顯微結(jié)構(gòu)。

3、超微結(jié)構(gòu)：也稱亞顯微結(jié)構(gòu)。指在電子顯微鏡下所觀察到的細胞結(jié)構(gòu)，如細胞核、線粒體、高爾基復合體、中心體、核糖體、微管、微絲等細胞器的微細結(jié)構(gòu)。

4、細胞培養(yǎng)：指活細胞在體外的培養(yǎng)技術(shù)，即在無菌條件下，從機體中取出組織或細胞、模擬機體內(nèi)正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓它在培養(yǎng)皿中繼續(xù)生存、生長和繁殖的方法。

5、原代培養(yǎng)：指從機體組織中取材后接種到培養(yǎng)基中所進行的細胞培養(yǎng)，即直接取材于機體的細胞培養(yǎng)。所形成的細胞稱原代細胞，它是在體外培養(yǎng)任何一種體細胞所必須經(jīng)歷的階段和傳代培養(yǎng)的基礎(chǔ)。

6、傳代培養(yǎng)：指當原代培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)瓶中生長、增殖到一定密度后，一分為二或以其他比例分裝或轉(zhuǎn)移到2個以上的培養(yǎng)瓶中所進行的再培養(yǎng)。

7、細胞融合：又稱為細胞雜交，指細胞彼此接觸時，2個或2個以上的細胞合并成為一個細胞的現(xiàn)象。8、cellline：原代培養(yǎng)首次傳代成功后，則稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系；已獲無限繁殖能力，能持續(xù)生存的細胞系，則稱為連續(xù)細胞系或無限細胞系。二、選擇題【A1型題】

1、A；2、B；3、B；4、A；5、C；6、D；7、A；8、D；9、C；10、D；11、C；12、A；13、A；14、B；15、C；16、A；17、E；18、A；19、C；20、D；21、C；22、E；23、A；24、D；25、B；26、E【A2型題】

1、E；2、D；3、C；4、D；5、A；6、B；7、C；8、D；9、D；10、A【X型題】

1、ACE；2、CDE；3、AE；4、CE；5、ABCD；6、ABC；7、ABCED；8、ACD；9、ABCD三、填空題

1、普通顯微鏡相差顯微鏡暗視野顯微鏡熒光顯微鏡2、照明系統(tǒng)光學放大系統(tǒng)機械裝置系統(tǒng)

3、電子照明系統(tǒng)電磁透鏡成像系統(tǒng)真空系統(tǒng)記錄系統(tǒng)電源系統(tǒng)4、物鏡和照明系統(tǒng)的位置顛倒

5、掃描電子顯微鏡透射電子顯微鏡6、0.1μm0.1mm3nm

7、差速離心法密度梯度離心法

8、0.2μmR=0.61λ／N.A.N.A.=nsinα／2

9、細胞化學法熒光細胞化學和免疫熒光鏡檢術(shù)放射自顯影技術(shù)細胞顯微分光光度測定技術(shù)流式細胞計量術(shù)細胞組分的分級分離法10、冰凍蝕刻

11、原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)

12、單層生長形態(tài)變成多態(tài)性具有接觸抑制現(xiàn)象13、體外環(huán)境不能與體內(nèi)的條件完全等同四、判斷題

1、√；2、×；3、√；4、×；5、√；6、×；7、√；8、√；9、√；10、×；11、√；12、×；13、×；14、×五、簡答題

1、光學顯微鏡上調(diào)節(jié)光線強弱的裝置有反光鏡、聚光鏡和光闌。

（1）反光鏡：反光鏡是安裝在鏡臺下面、鏡柱前方的面可轉(zhuǎn)動的圓鏡。用來調(diào)節(jié)光線，能將來自不同方向的光線收集起來反射到聚光鏡中。

（2）聚光鏡：聚光鏡是位于鏡臺下方的組透鏡，用以匯集光線使其成束，增強照明度和視野的亮度。

（3）光闌：光闌是位于聚光鏡底部的一個圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，裝有多片半月形的薄金屬片，疊合在中央形成弧形孔。圓環(huán)外源的突起小柄可調(diào)節(jié)金屬片的分開或合攏，作用是調(diào)節(jié)光線強弱，使物像變得清晰。2、電鏡和光鏡從光源、透鏡、成像和分辨力四方面不同。

（1）光源的不同：光學顯微鏡利用可見光作為光源，照明部分包括反光鏡、聚光鏡和光闌，可對入射光線進行集光并調(diào)節(jié)其強弱。電鏡是以電子束代替光源，以一根鎢絲作為陰極發(fā)射電子，電子受到陽極吸引而加快速度，加速的電子通過陽極的微孔形成電子束，構(gòu)成照明源。

（2）透鏡的不同：光學顯微鏡的透鏡由物鏡、目鏡組成，每種鏡頭由2～3個玻璃透鏡構(gòu)成，由于可見光能在空氣中直線前進，所以玻璃透鏡可直接在空氣中工作。電子顯微鏡使用產(chǎn)生軸對稱磁場的精密線圈作為電磁透鏡，以電磁場透鏡代替玻璃透鏡，但因為電子撞擊空氣分子將發(fā)生散射而不能直線前進，所以，鏡筒中的空氣必須抽出，保持高度真空。

（3）成像的不同：光學顯微鏡是通過物鏡和目鏡的組玻璃透鏡將標本上的微小物體放大成像。在電子顯微鏡下，標本通過一個氣閘送入真空鏡筒，經(jīng)聚光鏡匯聚的平行電子束被物鏡、中間鏡和投影鏡多級放大，最后在熒光屏上成像即時觀察，或投射到照相底片上成像使底片感光作為永久記錄。（4）分辨力不同：光學顯微鏡分辨力可達200nm（油鏡），電子顯微鏡分辨力為0.1nm。

3、如果含有很多的其他分子，會與電子發(fā)生碰撞，使電子散射，引起眩光，影響成像質(zhì)量；碰撞也會使電子束不穩(wěn)定，產(chǎn)生閃爍現(xiàn)象；灼熱的燈絲遇氣體也易腐蝕和斷裂。

4、因為電鏡是電子成像。肉眼無法觀察帶有“樣品信息”的電子束。所以要有記錄系統(tǒng)來記錄成像結(jié)果。5、照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人的眼睛。

6、冰凍蝕刻技術(shù)亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中，進行冰凍。然后用冷刀驟然將標本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出了斷裂面的結(jié)構(gòu)。冰升華暴露出標本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的步驟稱為蝕刻。蝕刻后，再向斷裂面上噴涂一層蒸氣碳和鉑。然后將組織溶掉，把金屬薄膜剝下來，此膜即為復膜。復膜顯示出了標本蝕刻畫的形態(tài)，可置于電鏡下觀察。電鏡下的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。

7、高等生物是由多細胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個細胞或某一群細胞在體內(nèi)的功能活動是十分困難的。但是如果把活細胞拿到體外培養(yǎng)進行觀察和研究，則要方便得多，培養(yǎng)中的細胞不受體內(nèi)復雜環(huán)境的影響，人為改變培養(yǎng)條件（如物理、化學、生物等外界因素的變化）即可進一步觀察細胞在單因素或多因素影響下的生理功能變化�；罴毎�離體后要在一定的生理條件下才能存活和進行生理活動，特別是高等動植物細胞要求的生存條件極其嚴格，稍有不適就要死亡。所以，細胞培養(yǎng)技術(shù)就是選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的最基本技術(shù)之一。

8、體外細胞培養(yǎng)技術(shù)的一般過程是：①準備工作，包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。②取材：在無菌環(huán)境／從機體取出某種組織細胞，經(jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接人培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如果是細胞株的擴大培養(yǎng)，則無取材這一過程。③培養(yǎng)：將取得的組織細胞接人培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如進行組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如進行分散細胞的培養(yǎng)，一般應(yīng)在接種于培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接種于培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞種于培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。9、體外培養(yǎng)細胞必須注意三個環(huán)節(jié)：物質(zhì)營養(yǎng)、生存環(huán)境和廢物的排除。

體外培養(yǎng)細胞所需的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基提供的。培養(yǎng)基通常含有細胞生長所需的氨基酸、維生素和微量元素。一般培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基，它含有細胞生長必需的營養(yǎng)成分：但是在使用合成培養(yǎng)基時需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，以牛血清為主。這是因為血清中含有多種促細胞生長因子和一些生物活性物質(zhì)。

由于血清中含有一些不明成分，對于特殊目的細胞培養(yǎng)是不利的。為此，研究人員正在探索無血清培養(yǎng)細胞的條件，并已經(jīng)取得一些進展。由于機體內(nèi)的細胞生長通常需要不同的細胞因子進行調(diào)節(jié)，所以，在無血清培養(yǎng)時仍然需要添加必要的因子，包括促細胞生長因子（如EGF），促貼附物（如層黏連蛋白）和其他活性物質(zhì)（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）。無血清培養(yǎng)排除了有血清培養(yǎng)時血清中不明因素的干擾，使實驗結(jié)果更加可靠。

體外細胞培養(yǎng)必須模擬體內(nèi)細胞生長的環(huán)境。環(huán)境因素主要是指無菌環(huán)境、合適的溫度、一定的滲透壓和氣體環(huán)境。氣體主要有兩種，即O2和CO2。后者對于維持細胞培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。

活體內(nèi)生長的細胞所產(chǎn)生的代謝物和廢物通過一定的系統(tǒng)進行利用和排除。體外培養(yǎng)細胞產(chǎn)生的代謝物和廢物積累在培養(yǎng)液中，所以定期更換培養(yǎng)液，對于體外細胞培養(yǎng)也是至關(guān)重要的。六、問答題

1、分辨力表示的是能夠區(qū)別兩個點間最近距離的能力，所以廣值越小，分辨力越高。從分辨力的表達式來看，NA越大，分辨力越高，或者波長越短，分辨力越高。

當以可見光作光源，玻璃透鏡的最大分辨力是多少呢？應(yīng)從以下幾個方面來考慮這一問題。首先應(yīng)如何盡可能地縮短波長�？梢姽獾牟ㄩL范圍是400～700nm，而可見光中的藍色光波長最短，為450nm，所以光鏡使用時應(yīng)濾去其他雜色光。第二是使NA的數(shù)值盡可能大，因為最好的玻璃透鏡的鏡口角是70°，所以sinα的最大值為0.94，空氣的折光率（n）為1，因此玻璃透鏡的最大數(shù)值孔徑為0.94。這樣，我們可以計算光鏡的最大分辨力了：假定用最好的玻璃透鏡，角孔徑為70°，用最短的可見光藍色光的波長為450nm，用空氣作為光的折射介質(zhì)，則最大分辨力為R=0.61λ／N.A.=0.61×450／0.94=292nm。

光鏡中的油鏡可用油作為光折射的介質(zhì)，由于油的折光率為1.5，所以用油鏡時，分辨力R=0.61λ／N.A.=0.61×450／1.5×0.94=196nm=0.2μm

在光學顯微鏡中，用紫外光作光源可使分辨率提高到0.1μm。紫外光的波長較短，約為200～300nm。但是，紫外光是肉眼不可見的，必須通過照相。另外，用紫外光源時需用石英透鏡，價格較高。

2、基本原理：動物高度分化的細胞核具有全套的個體遺傳信息，保持著全能性，有發(fā)育為完整個體的潛在能力。

基本步驟：

（1）取出一只成年母羊的乳腺上皮細胞，在低血清濃度下進行體外培養(yǎng)。（2）取出卵細胞供體母羊的卵母細胞進行去核處理。

（3）利用電融合技術(shù)使乳腺上皮細胞與去核卵母細胞進行電融合。（4）將融合細胞在體外培養(yǎng)至囊胚期。

（5）將囊胚移植到母羊的子宮內(nèi)，使其著床和發(fā)育，直至生出小羊。主要技術(shù)：細胞培養(yǎng)；細胞融合；胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。

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