食品微生物檢驗總結(jié)

1.食品微生物檢驗是應用微生物學的理論與方法，研究外界環(huán)境和食品中微生物的種類、數(shù)量、性質(zhì)、活動規(guī)律、對人

和動物健康的影響及其檢驗方法與指標的一門學科。2.食品微生物檢驗指標：（1）菌落總數(shù)：指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后1g[1ml或1cm2（表面積）]檢樣中

所含細菌菌落的總數(shù)。（2）大腸菌群：指一群在37攝氏度培養(yǎng)24小時能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭陰性無芽孢桿菌。（3）致病菌：即能夠引起人們發(fā)病的細菌。

3.ICMSF取樣方案：A.三級法用做菌落總數(shù)和大腸菌群；B.二級法用做致病菌。根據(jù)食品危害程度和指標嚴重程度劃

分。

4.美國FDA取樣方案P69自已畫圖

5.樣品可分為大樣、中樣、小樣。要準確區(qū)分。大樣指一整批；中樣是從樣品各部分取的混合樣，一般為200g;小樣又稱

為檢樣，一般以25g為準，用于檢樣.6.食品常用的采樣方法：（1）液體食品：充分混勻，用無菌操作拆開包裝，用100ml無菌注射器抽取，注入無菌盛樣容

器。（2）半固體食品：用無菌操作拆開包裝，用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，放入無菌盛樣容器。（3）固體樣品：大塊整體食的代表性，小塊大包裝食品應從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌盛樣容器（4）冷凍食品：大包裝小塊冷凍食品按小塊個體采取，大塊冷凍食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從凍快上鋸取樣品，也可以用無菌鉆頭鉆取碎屑狀樣品，放入無菌盛樣容品應用無菌刀具和鑷子從不同部位割取，割取時應兼顧表面與深部，注意樣品器（5）若需檢驗食品污染情況，可取表層樣品；若需檢驗其品質(zhì)情況，應取深部樣品。

7.樣品的制備是指對所采集的樣品再進行分取、粉碎以及混勻等過程。制備的方法可以根據(jù)被檢食品的性狀和檢驗要求，

采取剪碎振搖法、搗碎均質(zhì)法、胃蠕動均質(zhì)法、研磨法等。

8.檢樣處理：25+225做成一個均勻的1：10的10倍遞增稀釋液。9.菌落總數(shù)的測定：自已畫示意圖菌落總數(shù)檢驗程序水樣

做幾個適當倍數(shù)的稀釋度

選擇3個適宜稀釋度，各取1ml加入到滅菌平皿內(nèi)每個平皿內(nèi)加入45攝氏度左右的適量瓊脂

（36+-1）攝氏度（24+-1）h

菌落計數(shù)

報告

10.大腸菌群的檢驗:自已畫示意圖大腸桿菌為革蘭氏陰性菌

（1）檢樣的處理（2）初發(fā)酵（3）分離培養(yǎng)(4）證實實驗（5）報告：查MPN表11.致病菌的檢驗：自已畫示意圖

（1）沙門氏菌的檢驗：沙門氏菌為革蘭氏陰性菌

A.增菌：凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應經(jīng)過前增菌。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。B選擇性增菌C分離D生化實驗E血清學檢驗

（2）金黃色葡萄球菌的檢驗：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌

A檢樣的處理B增菌C分離培養(yǎng)D證實實驗

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1食品微生物檢驗定義：

應用微生物學的理論與方法，研究外界環(huán)境和食品中微生物的種類、數(shù)量、性質(zhì)、活動規(guī)律及其對人和動物健康的影響。

2食品微生物檢驗的特點：

1.研究對象及范圍廣2.涉及學科多樣3.實用性及應用性強4.采用標準化

3食品微生物檢驗的意義：

食品微生物檢驗方法為食品監(jiān)測必不可少的重要組成部分。

首先，它是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一，也是判定被檢食品能否食用的科學依據(jù)之一。

其次，通過食品微生物檢驗，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況，能夠?qū)κ称繁患毦�污染的程度作出正確的評價，為各項衛(wèi)生管理工作提供科學依據(jù)，提供傳染病和人類、動物的食物中毒的防治措施。

再次，食品微生物檢驗是以貫徹“預防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康；同時，它對提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟損失，保證出口等方面具有政治上和經(jīng)濟上的重大意義。

總之，食品微生物檢驗的目的：為生產(chǎn)出安全、衛(wèi)生、符合標準的食品提供科學依據(jù)。4食品微生物檢驗的范圍：

5食品微生物檢驗的指標

我國衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌。

（1）、菌落總數(shù)

菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。

（2）、大腸菌群

包括大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌的一些中間類型的細菌。寄居于人及溫血動物腸道內(nèi)隨大便排出體外。大腸菌群數(shù)越多，說明食品受糞便污染的程度越大。（3）、致病菌

（4）、霉菌及其毒素

有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引起疾病，故應檢驗。

6食品微生物檢驗的發(fā)展：(一)致病菌檢測階段（二）指示菌檢測階段

（三）微生態(tài)制劑檢測階段

（四）現(xiàn)代基因工程菌和尚未能培養(yǎng)菌的檢測7微生物檢驗實驗室

（一）微生物檢驗室基本條件

總要求：對各室的共同要求是高度的清潔衛(wèi)生，也就是要盡可能地創(chuàng)造無菌條件。

基本條件：微生物檢驗實驗室必須具備顯微鏡工作，微生物分離培養(yǎng)工作及基本化學工作順利進行的基本條件。具體要求：

1、光線明亮，但避免陽光直射室內(nèi)；

2、潔凈無菌，地面與四壁平滑，便于清潔和消毒；3、空氣清新，應有防風、防塵設備；

4、要有安全，適宜的電源和充足的水源；

5、具備整潔、穩(wěn)固、適用的實驗臺，臺面最好有耐酸堿、耐腐蝕的黑膠板；

6、顯微鏡及實驗室常用的工具、藥品應設有存放櫥柜。（二）微生物檢驗室實驗守則

在進行微生物檢驗時要時刻記�。何覀儗嶒灥脑S多對象可能是

病原微生物，如果不慎發(fā)生意外，不僅自身招致感染，而且可能造成病原微生物的傳播。

檢驗實驗室必須遵守以下守則：

1、包、衣物等勿帶入實驗室2、應戴口罩、帽子，換用專用鞋。3、保持安靜、有秩序，禁止飲食、吸煙等。4、檢驗前應登記日期、批號，詳記檢驗序號，日期，程序和結(jié)果5、室內(nèi)保持整潔，完畢后清理桌面。6、無菌室應備有專用開瓶器、金屬勺、接種針等，使用前后應灼燒滅菌。7、無菌室內(nèi)應備有盛放3％來蘇水或5％石炭酸溶液的玻璃缸，內(nèi)浸紗布數(shù)塊；備有75％酒精棉球；無菌室每

次使用前后，用紫外燈照射。8、吸過菌液的吸管，投入上述玻璃筒中，不得放桌上；菌液流灑桌面，用抹布浸沾上述溶液泡在污染部位，半小時后可抹去。若手上沾有活菌，也應在上訴消毒液中浸泡10～20min，再以肥皂及水洗刷。9、遇火險，應立即關閉電門、煤氣門，如果酒精、乙醚、汽油等著火，切勿用水，應以沙土等滅火。10、離開前用肥皂將手洗凈，脫去工作服、帽、專用鞋。關閉門窗以及水電煤氣等開關。

幾種意外情況的處理：

（1）皮膚破傷：先除盡異物，用蒸餾水和生理鹽水洗凈后，涂以2％碘酒。

（2）灼燒傷：涂以凡士林、5％的鞣酸或2％的苦味酸。（3）化學藥品腐蝕傷：若為強酸腐蝕，先用大量清水沖洗后，再用50g/L碳酸氫鈉或氫氧化銨溶液洗滌中和；若為強堿腐蝕，也先用大量清水沖洗后，再用5％醋酸或5％硼酸溶液洗滌中和。若受傷的是眼部，經(jīng)上述處理后，最后滴入橄欖油或液體石蠟1～2滴。

使用前準備：

用紫外線殺菌燈進行空氣消毒，開燈照射30min后關燈，間隔30min后方可進入室內(nèi)工作；

霉菌較多時，先用5％石炭酸全面噴灑室內(nèi)，再用甲醛熏蒸；細菌較多時，可采用甲醛與乳酸交替熏蒸。一般情況下，可酌情間隔一定時間用2ml/m3甲醛溶液或20ml/m3

丙二醇溶液熏蒸消毒。

無菌室的熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法。1、加熱熏蒸

2、氧化熏蒸（甲醛熏蒸后關門密閉應保持12小時以上，為減弱甲醛刺激，熏蒸后12h，再量取等量氨水，速放入室內(nèi)，同時敞開門窗以放出剩余刺激性氣體。）（三）無菌室無菌程度測定

測定無菌室無菌程度一般采用平板法：

滅菌的15ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蓋暴露于無菌室內(nèi)不同地方，10min后，蓋好皿蓋。倒置于37攝氏度培養(yǎng)24h后，觀察菌落情況，統(tǒng)計菌落數(shù)。每皿內(nèi)菌落數(shù)不超過4個，則可認為無菌程度良好，若菌落數(shù)很多，則應對無菌室進一步滅菌，滅菌后再檢驗。（四）常用儀器

超凈工作臺是箱式微生物無菌操作工作臺，占地面積小，使用方便。其工作原理是借助箱內(nèi)鼓風機將外界空氣強行通過一組過濾器，凈化的無菌空氣連續(xù)不斷地進入操作臺面，并且臺內(nèi)設有紫外線殺菌燈，可對環(huán)境進行殺菌，保證了超凈工作臺面的正壓無菌狀態(tài)。

高壓蒸汽滅菌鍋是應用最廣、效果最好的濕熱滅菌器，可用于培養(yǎng)基、生理鹽水、廢棄的培養(yǎng)物以及耐高熱藥品、紗布、采樣器械等的滅菌。高壓蒸汽滅菌鍋的種類有手提式、直立式以及橫臥式等多種，它們的構(gòu)造和滅菌原理基本相同。

高壓滅菌鍋為一雙層金屬圓筒，兩層之間盛水，外壁堅厚，其上方或前方有金屬厚蓋，蓋上裝有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸汽不能外溢，因而器內(nèi)蒸汽壓力可升高，其溫度也相應增高。高壓蒸汽滅菌鍋上還裝有排氣閥、安全閥，用來調(diào)節(jié)滅菌鍋內(nèi)蒸汽壓力與溫度并保障安全；高壓蒸汽滅菌鍋上還裝有溫度壓力表，指示內(nèi)部溫度與壓力。常用玻璃器皿

微生物檢驗室所用玻璃器皿，通常以中性硬質(zhì)玻璃制成。硬質(zhì)玻璃能耐受高熱、高壓，同時，其中游離堿含量較低，不至于影響基質(zhì)的酸堿度。

試管，培養(yǎng)皿，三角瓶，刻度吸管，試劑瓶，玻璃缸，玻璃棒，玻璃珠，滴瓶，玻璃漏斗，載玻片、凹玻片及蓋玻片，發(fā)酵罐，注射器及其大小針頭，量杯、量筒。新玻璃器皿洗滌

新玻璃器皿因含有游離堿，應先在清潔液或2%鹽酸內(nèi)浸泡數(shù)小時，再用自來水沖洗干凈。

（2）溫度計檢查法

用一支150℃的水銀溫度計（其結(jié)構(gòu)原理與體溫溫度計相似），使用前先將其水銀柱甩到0℃以下，插入滅菌物品內(nèi)層，按常規(guī)滅菌，滅菌完畢后，取出觀察，確定是否達到要求的溫度

2.滅菌效果檢驗常用方法

將有芽孢的細菌放在培養(yǎng)皿內(nèi)，用紗布包好，按常法滅菌。滅菌后取出培養(yǎng)皿，經(jīng)培養(yǎng)后若無細菌生長，即表示滅菌效果良好。玻璃器皿的滅菌

一般常用的玻璃器皿，在洗凈晾干后，才能滅菌。試管、三角燒瓶等，在滅菌之前，管口和瓶口塞好棉塞，在干熱滅菌器內(nèi)160℃，2h滅菌。培養(yǎng)皿滅菌前，用牛皮紙或廢報紙包好，每二對或五對為一包，排列在滅菌箱擱架上進行干熱滅菌。吸移管滅菌前，口上塞一小棉球，每支用紙包扎好，或置于金屬盒里，放在滅菌器內(nèi)滅菌。（六）幾個基本概念回顧：

一、滅菌

殺滅物體中或物體上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖體和芽孢的過程稱為滅菌，即滅菌是殺滅或消滅一定環(huán)境中的所有微生物。滅菌的方法分為物理滅菌法和化學滅菌法兩大類。二、消毒

用物理的、化學的或生物學的方法殺滅病原微生物的過程稱為消毒。具有消毒作用的藥物稱為消毒劑，一般消毒劑在常用濃度下，只對細菌的繁殖體有效，對于細菌芽孢則無殺滅作用。三、防腐

防止或抑制微生物生長繁殖的方法稱為防腐。用于防腐的藥物稱為防腐劑。某些藥物在低濃度時是防腐劑，在高濃度時則為消毒劑四、無菌

無菌是不含有活的微生物的意思。防止微生物進入機體或物體的方法叫無菌技術活無菌操作。進行微生物學實驗操作時，須嚴格注意無菌操作。

8食品微生物檢驗的一般步驟

9采樣的要求

1、嚴格遵守樣品采集的操作規(guī)程。

2、所采樣品必須具有代表性。

3、采樣操作要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、丟失。4、不得加入防腐劑、固定劑等。

5、樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加。10食品微生物檢驗的取樣方案①國際食品微生物學規(guī)范委員會（ICMSF）取樣方案；②美國FDA微生物學取樣方案；

③世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案;4其他方案。一、ICMSF方法

根據(jù)危害度的分類，將取樣方案分成二級法和三級法。在中等或嚴重危害的情況下使用二級抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級抽樣方案。

I類危害：老人和嬰幼兒食品及在食用前可能會增加危害的食品；

Ⅱ類危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不變；Ⅲ類危害：食用前經(jīng)加熱處理，危害減小的食品。將檢驗指標對食品衛(wèi)生的重要程度分成一般、中等和嚴重三檔

在進行詳細敘述之前，先解釋四個代號：n：系指同一批次產(chǎn)品應采集的樣品件數(shù)。c：最大可允許超出m值的樣品數(shù)。

m：微生物指標可接受水平的限量值。M：微生物指標的最高安全限量值。

①二級法：設定取樣數(shù)n，指標值m，允許有c個樣品其相應微生物指標檢驗值大于m值。

二級抽樣方案:自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點作為食品微生物的限量值，只設合格判定標準m值，超過m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格。

以生食海產(chǎn)品魚的副溶血性弧菌為例，n=5，c=0，m=100，n=5即抽樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，不得有超過m值（100）的檢樣，此批貨物為合格品。如果c0表明該批產(chǎn)品不合格。

②三級法：設定取樣數(shù)n，指標值m，附加指標值M，介于m與M之間的樣品數(shù)c。

按照三級采樣方案設定的指標，在n個樣品中，允許全部樣品中相應微生物指標檢驗值小于或等于m值；允許有c個樣品其相應微生物指標值在m值和M值之間；不允許有樣品相應微生物指標檢驗值大于M值。

例如：冷凍生蝦的細菌數(shù)標準n=5，c=3，m=10，M=100，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個檢樣的菌數(shù)是在m~M值（10~100）之間，如果有3個以上檢樣的菌數(shù)是在m~M值（10~100）之間或一個檢樣菌數(shù)超過M值（100）者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。

11食品微生物檢驗采樣原則

能采取完整包裝的樣品就不拆開取樣，必須拆開包裝

取樣的應按無菌操作進行取樣。12樣品的送檢要求

1、要快速運送：不要超過3小時；

2、若路途遙遠，可在1~5℃低溫下運送；3、要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；4、要填寫檢驗申請單。

13樣品的保留

（1）陰性樣品：在發(fā)出報告可及時處理；

（2）陽性樣品：在發(fā)出報告以后3天才能處理樣品；

（3）進口食品的陽性樣品：要保留6個月才能處理。（4）微生物檢驗不進行復檢14無菌技術

（一）什么是無菌技術

指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。（二）無菌環(huán)境

無菌室；無菌柜；超凈工作臺

1、無菌室

（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：更衣間、緩沖間、操作間（2）無菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外線照射（1~2小時）.每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）.每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。2、超凈工作臺

超凈臺的使用與保養(yǎng):

（1）風速保持在0.32-0.48米/秒;

（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上;

（3）讓超凈臺預工作10~15分鐘;

（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈.

（四）無菌操作

1、無菌操作目的：

（1）保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染；

（2）防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員。2、進入無菌室前的準備

（1）定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；（2）用紫外線滅菌處理30~60分鐘；（3）檢查無菌器材是否完備；

（4）洗手消毒；

（5）手部消毒后，再穿戴無菌工作服。3、檢驗操作過程的無菌操作要求

（1）在操作中不應有大幅度或快速的動作；

（2）使用玻璃器皿應輕取輕放。（3）在正火焰上方操作；

（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5）在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應輕、準。

（6）不能用嘴直接吸吹吸管。

（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。

15微生物的接種

將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。常用的接種方法有以下幾種：

１）劃線接種２）三點接種３）穿刺接種４）澆混接種５）涂布接種６）液體接種７）注射接種８）活體接種分離純化方法：

１.傾注平板法２.涂布平板法３.平板劃線法

16菌落形態(tài)學BacterialColonyMorphology

有莢膜的細菌菌落較大并且表面光滑，而沒有莢膜的則表面較粗糙；

具有芽孢的細菌菌落表面常有褶皺并且不透明。

沒有鞭毛不運動的細菌，特別是球菌，常形成較小、較厚、邊緣較整齊的菌落；有鞭毛的細菌則較大而扁平，邊緣波狀、鋸齒狀等；

17細菌的生化反應檢查法

由于細菌各自酶系統(tǒng)不同，新陳代謝的產(chǎn)物也有所不同，而這些產(chǎn)物又各具有不同的生物化學特性。為此，可利用生物化學的方法來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的細菌，這種試驗稱為細菌的生化反應試驗。1.在培養(yǎng)物中加入某種底物與指示劑，經(jīng)接種、培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基的PH值變化。2.在培養(yǎng)物中加入試劑，觀察它們同細菌代謝產(chǎn)物所生成的顏色反應。3.根據(jù)酶作用的反應特性，測定酶的存在。4.根據(jù)細菌對理化條件和藥品的敏感性，觀察細菌的生長情況。

生化試驗的注意事項

1、待檢菌應是新鮮培養(yǎng)物。培養(yǎng)18-24h。2、待檢菌應是純種培養(yǎng)物。

3、遵守觀察反應的時間。觀察結(jié)果的時間，多為24或48小時。

4、應做必要的對照試驗。

5、提高陽性檢出率，至少挑取2-3個待檢的疑似菌落分別進行試驗。

生化試驗分類

（一）糖類代謝試驗

（二）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗（三）有機酸鹽和銨鹽代謝試驗（四）酶類試驗

18糖(醇)發(fā)酵試驗

原理糖類是作為碳源和能量來源提供細菌合成菌體成分必需的原料，由于細菌各自有不同的酶系統(tǒng)，故對糖(醇)類的分解能力不盡相同。有的能分解某些糖類，生

成酸又生成氣體，有的雖能分解這些糖類但只能生成酸不能生成氣體，有的則根本不能分解。借此特點，可作為鑒定細菌的依據(jù)之一。該試驗檢查細菌對加在基礎培養(yǎng)基中的特殊的糖發(fā)酵(降解)后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力。方法

(1)試劑：糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，常用的指示劑主要有酚紅、溴麝香草酚藍、溴甲酚紫和酸性復紅等。前二者顏色反應較敏感，但穩(wěn)定性較差。后二者比較穩(wěn)定。特別是對發(fā)酵遲緩的細菌，培養(yǎng)時間較長，則以后二者為優(yōu)。(2)培養(yǎng)基：液體糖發(fā)酵管，半固體糖發(fā)酵管，固體糖發(fā)酵管，雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管。

(3)操作：以無菌操作的方法將經(jīng)分離培養(yǎng)的純種細菌接種到糖(醇)發(fā)酵培養(yǎng)基中，置溫箱內(nèi)，按各類菌所要求溫度(通常為37℃)經(jīng)一定時間(數(shù)小時至二周)培養(yǎng)，然后觀察結(jié)果。

記錄：

產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，陽性，以“+”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陽性，以“”表示不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，陰性，以“-”表示

19甲基紅(MR)試驗

原理：某些細菌分解葡萄糖的過程中產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進一步被代謝成為乳酸，乙酸，甲酸等。使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色為陽性；有些細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，最終的酸類較少，培養(yǎng)基pH較高，加入甲基紅指示劑呈黃色為陰性反應。因此該試驗是檢查細菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生并保持穩(wěn)定的酸性終末產(chǎn)物和克服體系緩沖作用的能力，某些細菌比其他細菌能夠產(chǎn)生更多的酸。方法

(1)培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水(MR/VP培養(yǎng)基)。

(2)試劑：甲基紅指示劑。(3)操作：待檢菌18～24h純培養(yǎng)物接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中；37℃培養(yǎng)2～3d，每2ml培養(yǎng)液加2滴甲基紅指示劑，立即觀察。

結(jié)果

MR陽性：培養(yǎng)物有足夠的酸，能使培養(yǎng)基表面甲基紅試劑仍保持明顯的紅色(pH4.4)；

MR陰性：培養(yǎng)基表面呈黃色(pH6.0)；

延遲反應：橙色，應繼續(xù)孵育到4天，并重復試驗。

20硫化氫試驗

原理：某些細菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可與加入培養(yǎng)基中的鉛或鐵離子生成黑色硫化物。方法與結(jié)果

(1)瓊脂穿刺法：

培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養(yǎng)基。操作：將試驗細菌以接種針沿管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃24h培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變黑色為陽性。當產(chǎn)生硫化氫量少時，為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時，一定要沿培養(yǎng)基管壁進行。

(2)醋酸鉛試紙法：培養(yǎng)基：含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基、浸有醋酸鉛的濾紙條。操作：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，37℃培養(yǎng)24～48h。

結(jié)果：試紙呈黑色為陽性。該法較敏感。21血漿凝固酶試驗

原理金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細菌的表面，產(chǎn)生凝固。凝固酶可分為兩種，一種是與細胞壁結(jié)合的凝固酶，可用玻片法測定；另一種是菌體生成后釋放于培養(yǎng)基中的游離凝固酶，可用試管法測出。方法

(1)玻片法：在玻片上分別滴加新鮮人或兔血漿及生理鹽水各一滴，挑取待檢菌的菌落，分別與血漿和生理鹽水混合，立即觀察結(jié)果，如血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)，而生理鹽水中無自凝現(xiàn)象為陽性。

(2)試管法：小試管3支內(nèi)各加入l4稀釋的新鮮人或兔血漿0.5ml，其中一支加待檢菌18～24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml，另一支加陽性菌株18～24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml，再一支加肉湯培養(yǎng)基0.5ml為陰性對照，輕振混勻。3支試管放37℃水浴中3～4h，觀察結(jié)果。

結(jié)果待檢菌株管和陽性菌株管出現(xiàn)凝固，陰性對照管不出現(xiàn)凝固，為陰性。

21抗原定義：抗原是指進入動物體內(nèi)能刺激動物的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞，并能和抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的物質(zhì)。完全抗原包括下面兩方面的免疫性能：

A免疫原性指抗原進入體內(nèi)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細胞特性，具有這種能力的物質(zhì)稱為免疫原；B免疫反應性指抗原能和對應的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性反應的特性，又稱為反應原性。

半抗原：有些物質(zhì)，例如某些真菌毒素，單獨存在時只有反應原性而無免疫原性，是非免疫原物質(zhì)，被稱為半

抗原。半抗原必須經(jīng)過改造后才具有免疫原性。22抗體

定義：抗體Ab是由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后，由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白Ig。通常Ab和Ig可作為同義詞使用。

23抗原－抗體反應概念：即抗原和抗體之間的特異性反應，可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外，前者可以介導體內(nèi)毒素中和、殺菌和溶菌等作用，后者在體外進行，是免疫檢測技術的基礎，但是它們的基本反應特性是相同的。在進行體外免疫學實驗時，通常是以存在于血清中的抗體(也是抗體的主要存在形式)為材料進行的，所以體外免疫學反應又稱為血清學反應。

原抗體反應的原理

抗體（Ab)是球蛋白分子，在水溶液中，由于分子之間電荷等的相互作用而呈膠體狀，不會自然沉淀，同樣(可溶性)抗原(例如蛋白質(zhì))在溶液中一般也不會自然沉淀。當抗原(Ag)和對應的特異性抗體結(jié)合反應時，電荷減少或消失從而使它們由親水膠體變?yōu)槭杷�膠體，形成肉眼可見的抗原-抗體復合物。

反應過程：①不可見階段②可見階段

抗原-抗體反應的特性：特異性；可逆性；比例性

24常見的血清學反應

１、凝集反應2．沉淀反應

3、補體結(jié)合試驗4．免疫標記技術

25菌落總數(shù)的幾個概念

菌落總數(shù)：AerobicPlateCount，食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培基、溫度、時間、pH、需氧性質(zhì)等）所得1mL（g）檢樣中形成微生物菌落的總數(shù)。只包括一群在平板技術瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)不等于細菌總數(shù)。

菌落：單個微生物在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見有一定細菌群落。

CFU:ColonyFormingUnits，菌落形成單位。26大腸菌群的定義及范圍

大腸菌群系一群在37℃，24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群主要是由腸桿菌科中四個菌屬內(nèi)的一些細菌所組成，即艾希氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬及陰溝腸桿菌屬。

27食物中毒

概念：指攝入了含有生物性、化學性有害物質(zhì)的食品或把有毒有害物質(zhì)當作食品攝入后出現(xiàn)的非傳染性的急性、亞急性疾病。

特點：潛伏期短，來勢急劇，短時多人同時發(fā)�。慌R床表現(xiàn)大致相同；與吃某種有毒食品有關；發(fā)病率高，人與人之間并不傳染。

分類：微生物性（細菌性、真菌性），化學性，動、植物性，以細菌性最常見。28細菌性食物中毒

概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起以急性腸胃炎為主的疾病。分類：感染型、毒素型、不定型

前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細菌恢復活力;BPW

選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢繁殖，其它細菌受到抑制;SC+TTB

選擇性平板分離培養(yǎng)：BS+XLD/HE/顯色培基

生化試驗：鑒定分離出來的細菌是否符合沙門氏菌的生化譜，可采用API20E等成套生化試劑

血清學鑒定：特異性診斷血清鑒定到種

SC（亞硒酸鹽TTB（四硫磺酸鈉

MM

胱氨酸增菌液）煌綠增菌液）亞硒酸鹽抑菌四硫酸鈉和煌綠氯化鎂和孔胱氨酸促生長抑菌適合傷寒沙門

雀綠抑菌

適合其他沙門菌生長，菌和甲型副傷

42℃，18~24h

寒沙門菌生長，為防漏檢宜SC+TTB/MM

37℃

指示

指示效果及可疑菌落特點

系統(tǒng)葡

萄黑色有金屬光澤、棕褐或灰色，周圍培基

BSDHLSSHEWS

+H2S黑或棕色，或不產(chǎn)硫化氫而呈灰綠色乳糖+

H2S乳糖（+）：粉紅色，（-）：無色半透明乳糖+無色半透明，產(chǎn)硫化氫者中心黑色H2S乳糖+H2SH2S

乳糖（+）：黃色，（-）：藍色

乳糖+藍綠色或藍色，產(chǎn)硫化氫者中心黑色29沙門氏菌形態(tài)與染色

沙門氏菌為革蘭氏陰性較為細長的桿菌，(1~3)m×(0.4~0.9)m；不產(chǎn)生芽胞，一般無莢膜，但在粘液樣變異時，可見菌體周圍粘液層增厚。除雞白痢和雞傷寒沙門氏菌外，其余都具有周身鞭毛，能運動，但也偶爾出現(xiàn)無鞭毛的變種和不運動變株。除雞白痢和雞傷寒沙門氏菌及仙臺、傷寒、甲型副傷寒等沙門氏菌外，絕大多數(shù)都具有纖毛，能吸附于細胞表面和凝集紅血球。培養(yǎng)特性

沙門氏菌為需氧或兼性厭氧菌，一般在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后呈圓形、光滑、濕潤、半透明、邊緣整齊、直徑2mm～3mm；粗糙型菌落，邊緣不整齊，表面干燥。但雞白痢、雞傷寒和甲型傷寒沙門氏菌等在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長貧瘠，形成侏儒型的菌落，乙型副傷寒沙門氏菌和霍亂沙門氏菌可呈粘液狀生長，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后再置室溫1d～2d，則可看到菌落周圍有一圈粘液堤。

沙門氏菌最適生長溫度為35℃～37℃，10h～42h能生長，最適生長pH為7.2～7.4。在培養(yǎng)基中若加入硫代硫酸鈉、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、腦心浸液、膠體硫或甘油等，均有助于本菌的生長。

沙門氏菌屬按其生化特性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五個亞屬，其中亞屬Ⅲ又稱為亞利桑那菌，它們在亞硫酸鉛瓊脂、DHL瓊脂、HE瓊脂和SS瓊脂平板上培養(yǎng)特性各不相同。

抗原結(jié)構(gòu)

a菌體抗原(Ｏ抗原)；b鞭毛抗原(H抗原)；

c表面抗原又稱K抗原（Vi抗原和M抗原、5抗原）；d菌毛抗原（F抗原）。

抗原變異

H－O變異；S－TR變異；型體變異（O變異、

V－W變異）；位相變異

初步生化試驗做三糖鐵(TSI)試驗

三糖鐵試驗主要是測定細菌對葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、產(chǎn)氣和產(chǎn)硫化氫情況，三糖鐵（TSI）試驗原理

原理：三糖利用培養(yǎng)基：干粉或生化管接種方法：穿刺劃線

結(jié)果：產(chǎn)酸／堿，產(chǎn)氣，硫化氫

注意：高層斜面

三糖鐵培養(yǎng)基成分除牛肉膏、蛋白胨外，主要有葡萄糖(1g/L)、乳糖(10g/L)、蔗糖(10g/L)、二價鐵鹽、酚紅等，pH為7.4。培養(yǎng)基做好后，擺成高層斜面，培養(yǎng)基顏色為磚紅色。使用時先將待檢菌株穿刺接種，然后再將待檢菌株劃線接種于高層斜面上，36℃培養(yǎng)18～24h。

國標中采用靛基質(zhì)、尿素、氰化鉀和賴氨酸四項生化試驗。若硫化氫＋、靛基質(zhì)－、尿素－、氰化鉀－、賴氨酸＋，可判斷為沙門氏菌屬，這是典型沙門氏菌的反應。

若分解硫化氫則產(chǎn)生黑色FeS沉淀，若分解糖類產(chǎn)氣則可見氣泡或裂縫；只有斜面和底層均產(chǎn)酸，且賴氨酸脫羧酶陰性者才可排除為沙門菌的可能性；

其余情況既可能是也可能不是沙門氏菌屬的細菌。30玻片凝集法原理

單價血清：含單一抗體的血清

多價血清：含多種抗體的血清如A~F多價

步驟：先多價后單價，先常見的后不常見的，先O后H，根據(jù)結(jié)果查表得到鑒定菌種

抗原準備：多采用15g/L瓊脂斜面培養(yǎng)物，若O血清不凝集可轉(zhuǎn)種至高含量（2.5~3%）瓊脂培基上，干燥利于O-Ag發(fā)育。

操作：先應在玻片上滴加1滴生理鹽水，加入菌苔做陰性對照并觀察是否自凝，若有則說明該菌株發(fā)生S-R變異失去了O抗原成為粗糙型，故不能進行血清學分型。31血清學實驗原理

不常見的菌型，先用163種沙門菌血清中的8種多價血清排查，若其中任一種或兩種凝集則再用其所包含的各種H因子逐一檢查。H多價1：a,b,c,d,I

H多價2：eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gq,mt,gz51,H多價3：k,r,y,z,z10,lv,lv,lz13,lz28,lz40H多價4：1，2；1，5；1，6；1，7；z6

H多價5：z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38H多價6：z39,z41,z42,z44H多價7：z52,z53,z54,z55H多價8：z56,z57,z60,z61,z62

32金黃色葡萄球菌形態(tài)與染色典型的葡萄球菌呈球形，直徑0.4m-1.2m，致病性葡萄球菌一般較非致病性菌小，且各個菌體的大小及排列也較整齊。細菌繁殖時呈多個平面的不規(guī)則分裂，堆積成為葡萄串狀排列。在液體培養(yǎng)基中生長，常呈雙球或短鏈狀排列，易誤認為鏈球菌。葡萄球菌無鞭毛及芽胞，一般不形成莢膜，易被堿性染料著色，G+，當衰老、死亡或被白細胞吞噬后常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性，對青霉素有抗藥性的菌株也為革蘭氏陰性。分類

葡萄球菌屬于微球菌的葡萄球菌屬；

按菌落色素，分為金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌和檸檬色葡萄球菌三種。但是這種色素指標很不穩(wěn)定。按葡萄球菌的生理化學組成，分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌三種。其中金黃色葡萄球菌多為致病性菌，表皮葡萄球菌偶爾致病，腐生葡萄球菌一般為非致病菌。

培養(yǎng)特性

營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好。需氧或兼

性厭氧，最適生長溫度為37℃，最適pH值為7.4。在普

通營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)24h-48h后，可形成圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤、有光澤、不透明菌落。菌落

直徑通常在1mm-2mm，但也有大至4mm-5mm者。金葡在Baird-Parker平板上菌落直徑2~3mm，灰色到黑色，邊緣淡色，周圍有一渾濁帶，外層有一透明圈。接種針接觸有奶油至樹脂硬度。偶見非脂肪溶解的類似菌落耽誤渾濁帶和透明圈。

在血瓊脂平板上，形成的菌落較大，多數(shù)致病性菌株可產(chǎn)生溶血毒素，使菌落周圍產(chǎn)生透明的溶血圈(β溶血)。生化特性

本屬細菌大多數(shù)不能分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖。產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。致病菌株能分解甘露醇，產(chǎn)酸。甲基紅陽性，VP為弱陽性，多數(shù)菌株能分解尿素產(chǎn)氨，還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚。

毒素與酶

葡萄球菌的致病力決定于細菌產(chǎn)生的毒素和酶的能力。是不是致病的金黃色葡萄球菌主要看它是否產(chǎn)生凝固酶。1、溶血毒素2、殺白血球毒素3、腸毒素4、血漿凝固酶5、溶纖維蛋白酶6、透明質(zhì)酸酶7、脫氧核糖核酸酶33溶血性鏈球菌的檢驗

致病性鏈球菌可產(chǎn)生的毒素和酶

1、溶血素2、致熱外毒素3、透明質(zhì)酸酶4、鏈激酶5、鏈道酶6、殺白細胞素

34副溶血性弧菌的檢驗

副溶血性弧菌系分布在海洋及鹽湖極為廣泛的一種致病性嗜鹽菌。副溶血弧菌的多形性與球狀體是它與氣單胞菌屬在形態(tài)學上的主要鑒別特征。

35罐頭食品商業(yè)無菌檢驗

罐頭食品的商業(yè)無菌：罐頭食品經(jīng)過適度的殺菌后，不含有致病微生物，也不含有通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物的狀態(tài)。

密封：食品容器經(jīng)密閉后能阻止微生物進入的狀態(tài)。胖聽：由于罐頭內(nèi)微生物活動或者化學作用產(chǎn)生氣體，形成正壓，使一端或兩端外凸的現(xiàn)象。

泄漏：罐頭密封結(jié)構(gòu)有缺陷，或由于撞擊而破壞，或罐壁腐蝕而穿孔致使微生物入侵的現(xiàn)象。

罐頭腐敗變質(zhì)的原因

罐頭腐敗變質(zhì)的原因有化學因素，如中酸性罐頭容器

的馬口鐵與內(nèi)容物相作用引起的氫膨脹；物理因素，如貯存溫度過高，排氣不良，金屬容器腐蝕穿孔等；更主要的引起腐敗的原因是罐內(nèi)污染了微生物而導致腐敗變質(zhì)。這些微生物的污染來源有兩種情況：

(一)殺菌后罐內(nèi)殘菌有微生物

罐頭殺菌要考慮罐內(nèi)食品的營養(yǎng)性質(zhì)，因為商業(yè)滅菌只強調(diào)殺死病原菌、產(chǎn)毒菌，并沒達到完全無菌的狀態(tài)。罐內(nèi)可能有一些非致病的微生物存在，在罐內(nèi)的特殊環(huán)境下，一定保存期限內(nèi)，一般不會生長繁殖，但如罐內(nèi)條件有變化，就會生長繁殖而導致罐頭腐敗變質(zhì)。經(jīng)高壓蒸汽殺菌后的罐頭內(nèi)殘留的微生物大多是耐熱性的芽胞細菌。(二)殺菌后發(fā)生漏罐

由于罐頭密封性能不好，殺菌后發(fā)生漏罐而造成微生物污染。通過漏罐而造成污染的主要污染源是冷卻水。罐

頭在熱處理后要通過冷卻水進行冷卻，冷卻水中的微生物就有可能通過漏罐處進入罐內(nèi)�？諝庖彩窃斐陕┕尬廴镜�

污染源，但不占主要地位。通過漏罐處污染的微生物種類很多，包括耐熱菌和其他各類細菌。罐藏食品腐敗的類型

罐頭由于微生物作用而造成的腐敗變質(zhì)，可分為嗜熱芽胞細菌、中溫芽胞細菌、不產(chǎn)芽胞細菌、酵母菌、霉菌等引起的腐敗變質(zhì)。

(一)嗜熱芽胞細菌引起的腐敗變質(zhì)

發(fā)生這類變質(zhì)大多數(shù)是由于殺菌溫度不夠而造成的。通常發(fā)生三種類型的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。

1、平酸腐敗

平酸腐敗也叫平蓋酸敗。導致平酸腐敗的微生物習慣上稱平酸菌，大多數(shù)是兼性厭氧菌。平酸腐敗無法通過不開罐檢查發(fā)現(xiàn)，必須通過開罐檢查或細菌分離培養(yǎng)才能確定。另一類細菌是凝結(jié)芽胞桿菌，它是肉類和蔬菜罐頭腐敗變質(zhì)的常見菌，又稱為嗜熱酸芽胞桿菌。

2、TA菌腐敗

TA菌是不產(chǎn)硫化氫的嗜熱厭氧菌的縮寫，產(chǎn)生酸和氣體，主要有二氧化碳和氫氣。這類菌中常見的有嗜熱解糖梭狀芽胞桿菌。由于TA菌在瓊脂培養(yǎng)基上不易生成菌落，所以通常只采用液體培養(yǎng)法來檢查產(chǎn)氣和產(chǎn)酸的情況。3、硫化物腐敗

腐敗的罐頭內(nèi)產(chǎn)生大量黑色的硫化物，沉積于罐內(nèi)壁和食品上。引起這種腐敗變質(zhì)的菌是致黑梭狀芽胞桿菌，能較快地分解硫含的氨基酸而產(chǎn)生硫化氫氣體。(二)中溫芽胞細菌引起的腐敗變質(zhì)1、中溫需氧芽胞細菌引起的腐敗變質(zhì)

常見的引起罐頭腐敗變質(zhì)的中溫芽胞細菌有：枯草芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌等，它們能分解蛋白質(zhì)和糖類，分解產(chǎn)物主要有酸及其他一些物質(zhì)，一般不產(chǎn)生氣體。

2、中溫厭氧梭狀芽胞細菌引起的腐敗變質(zhì)

這類菌中有分解糖類的丁酸梭菌和巴氏固氯梭狀芽胞桿菌，還有一些能分解蛋白質(zhì)的菌種，如魏氏梭菌、生芽胞梭菌及肉毒梭菌等，此外往往還產(chǎn)生毒性較強的外毒素，肉毒梭菌是最強的一種，常以此菌作為殺菌是否徹底的指示細菌。

(三)不產(chǎn)芽胞細菌引起的腐敗變質(zhì)

常常是由于漏氣而造成的，冷卻水是重要的污染源；不產(chǎn)芽胞細菌的檢出有時是由于殺菌溫度不夠而造成的。罐頭中污染的不產(chǎn)芽胞細菌有兩大類群：

一類是腸道細菌；另一類不產(chǎn)芽胞的細菌主要是鏈球菌。(四)酵母菌引起的腐敗變質(zhì)

這類變質(zhì)往往發(fā)生在酸性罐頭或高酸性罐頭中。主要種類有圓酵母、假絲酵母和啤酒酵母等。主要是由于漏罐造成的，有時也因殺菌溫度不夠造成。

(五)霉菌引起的腐敗變質(zhì)

可能由于罐頭真空度不夠，或者漏罐造成，常見于酸性罐頭，引起罐頭變質(zhì)的霉菌主要有：青霉、曲霉、檸檬酸霉屬等。

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