獸醫(yī)微生物實習(xí)總結(jié)

動物科技學(xué)院

本、專科生畢業(yè)實習(xí)總結(jié)

姓名：學(xué)院：專業(yè)：班級：學(xué)號：

201*年5月31日

學(xué)生姓名指導(dǎo)教師學(xué)號專業(yè)班級實習(xí)地點預(yù)防獸醫(yī)微生物實驗室一、實習(xí)目的、任務(wù)1.熟悉實驗室內(nèi)微生物鑒定的基本流程。2.熟練實驗室內(nèi)細(xì)菌的鑒定的操作3.了解沙門氏菌形態(tài)與染色特性以及主要培養(yǎng)特性；4.熟悉沙門氏菌常規(guī)微生物學(xué)診斷法；5.掌握沙門氏菌生化試驗的方法和原理；6．熟悉沙門氏菌在選擇性和鑒別培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)；二、實習(xí)內(nèi)容未知細(xì)菌的分離鑒定和培養(yǎng)，生化特性，以及微生物實驗室常用的實驗操作三、實習(xí)效果與收獲通過這次實習(xí)，使我意識到了自身存在的一些不足，比如動手能力太差，對書本上的知識理解不夠深入，最重要的是通過這次實習(xí)，我收獲了很多。這次實習(xí)，我主要做的是對一個細(xì)菌的簡單的鑒定。沙門氏菌屬(Salmonella)是腸桿菌科的一個大屬，有201*多個血清型，我國發(fā)現(xiàn)的約有100個。沙門氏菌廣泛存在于豬、牛、羊、家禽、鳥類、鼠類等多種動物的腸道和內(nèi)臟中。1880年Eberth首先發(fā)現(xiàn)傷寒桿菌，1885年Salmon分離到豬霍亂桿菌，由于Salmon發(fā)現(xiàn)本屬細(xì)菌的時間較早，在研究中的貢獻(xiàn)較大，遂定名為沙門氏菌屬Salmonella。本屬細(xì)菌絕大多數(shù)成員對人和動物有致病性，能引起人和動物的敗血癥與胃腸炎，甚至流產(chǎn)，并能引起人類食物中毒，是人類細(xì)菌性食物中毒的最主要病原菌之一。1實驗材料1.1菌種：待檢的病鴨體內(nèi)分離的沙門氏菌1.2培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基、普通平板、麥康凱平板、三糖鐵高層斜面、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水1.3生化管：葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素1.4生化試劑：吲哚試劑、M-R試劑、V-P試劑2實驗內(nèi)容2.1配培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取33.0g營養(yǎng)瓊脂于1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)PH7.3±0.1，121℃高壓滅菌15min，冷卻后制成平板。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：稱取55.0g麥康凱瓊脂于1000mL蒸餾水中加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)PH7.2±0.2，121℃高壓滅菌20min，冷卻后無菌條件下制成平板。三糖鐵瓊脂：稱取三糖鐵瓊脂63.4g于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后制成高層斜面。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖微量生化管（購自杭州天和微生物試劑有限公司）；胰蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水麥康凱培養(yǎng)基，呈紅褐色，用于腸道菌的分離與鑒定；能分解乳糖的細(xì)菌--菌落紅色；不能分解乳糖的細(xì)菌菌落灰白色。三糖鐵瓊脂，制成三糖鐵高層斜面，呈紅褐色，用于測定細(xì)菌對葡萄糖、乳糖、蔗糖的發(fā)酵作用及能否產(chǎn)生硫化氫；能發(fā)酵乳糖、蔗糖，培養(yǎng)基呈黃色；發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖、蔗糖，底層呈黃色、斜面部分為紅色(少量酸接觸空氣而氧化細(xì)菌生長利用含氮物質(zhì),生成堿性化合物)；能產(chǎn)生硫化氫，培養(yǎng)基呈黑色；能產(chǎn)氣的細(xì)菌，底層瓊脂內(nèi)有氣泡。葡萄糖蛋白胨水，黃色液體培養(yǎng)基，用于增菌培養(yǎng)，做MR,VP試驗。蛋白胨水，無色液體培養(yǎng)基，用于增菌培養(yǎng)，做吲哚試驗。2.2細(xì)菌的分離培養(yǎng)無菌條件下將待檢菌，取單菌落分別接種于普通培養(yǎng)基，麥康凱，恒溫培養(yǎng)24-48小時后觀察菌落的生長情況觀察每種平板上細(xì)菌的生長情況，比較單個菌落的形態(tài)：染色鏡檢。2.3觀察結(jié)果觀察麥康凱、普通平板上細(xì)菌生長情況。該分離菌在普通瓊脂平板上可形成灰白、圓形、光滑、濕潤、微隆起、邊緣光滑、直徑1~2mm的菌落;在麥康凱培養(yǎng)基上長成半透明、圓形、濕潤、直徑約0.5~1mm的菌落。該分離菌為革蘭氏陰性小桿菌。分離培養(yǎng)實驗操作過程中由于實驗不小心出現(xiàn)了寫差錯，麥康凱平板上長有兩種菌落，粉紅色與灰白色中間帶一黑點的菌落。粉紅色的是大腸桿菌，能分解乳糖，第一次劃線處有菌苔生成，第二次劃線處有較多單個菌落出現(xiàn)，直徑約2mm，為扁形光滑突起粉紅色菌落，第三次劃線處基本沒有菌落出現(xiàn)；白色中間帶一黑點的菌落為沙門氏菌，不能分解乳糖，第一次劃線處看不到，第二次劃線處有沙門氏菌菌落，但是僅觀察到3個菌落，為扁形光滑突起灰白色菌落，直徑約1.5mm，第三次劃線處基本無細(xì)菌。分析此培養(yǎng)基結(jié)果，成功分離得到沙門氏菌的菌落，達(dá)到實驗?zāi)康�，但是劃線技術(shù)不夠成熟，劃線后細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長的線條不優(yōu)美，非常凌亂。普通平板上也成功分離得到沙門氏菌的菌落，達(dá)到實驗?zāi)康�，但是依舊劃線技術(shù)不夠成熟，劃線結(jié)果不甚理想。挑取麥康凱培養(yǎng)基上的沙門氏菌的菌落，做鏡檢，革蘭氏染色，結(jié)果顯示大部分為紫色，少部分為紅色，染色結(jié)果不甚理想，但是可以觀察到是桿菌。革蘭染色脫色時間不夠，沒有染好，技術(shù)不夠成熟。2.4做生化試驗2.4.1五糖發(fā)酵試驗在無菌條件下，用接種針將分離純化的疑似大腸桿菌單菌落接種于五糖微量反應(yīng)管，并封口標(biāo)號，置于37℃恒溫培養(yǎng)22-24h后觀察結(jié)果。變黃色者為陽性，不變色者為陰性。4.2三糖鐵試驗陰性。2.4.2三糖鐵試驗用接種針將疑似大腸桿菌單菌落劃線接種于三糖鐵斜面上并進(jìn)行穿刺，于37℃恒溫培養(yǎng)22-24h后觀察斜面底層顏色變化及產(chǎn)氣情況。若斜面和底層變黑則有H2S產(chǎn)生。若斜面和底層均變成黃色為產(chǎn)酸，若為紅色為產(chǎn)堿。2.4.3IMVC試驗吲哚試驗：將疑似大腸桿菌的菌落分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，在培養(yǎng)24h后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加3-4滴二甲苯，搖動數(shù)次，靜置1-3min，待二甲苯上升后，沿試管壁徐徐加入兩滴吲哚試劑，觀察其顏色變化。在二甲苯和培養(yǎng)物之間出現(xiàn)玫瑰紅色者為陽性反應(yīng)，不變色者為陰性。甲基紅試驗：將疑似大腸桿菌的菌落分別接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，在培養(yǎng)24h后的葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入甲基紅試劑5滴，培養(yǎng)基呈紅色者為陽性，呈黃色者為陰性。VP試驗：將疑似大腸桿菌的菌落分別接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，將葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)物內(nèi)加入3-5滴6％α萘酚溶液（甲液），然后加入等量的16％KOH（乙液），用力振蕩，數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽性，不變色者為陰性。檸檬酸鹽利用試驗：用接種針將疑似大腸桿菌單菌落劃線接種于檸檬酸鹽斜面上并進(jìn)行穿刺，培養(yǎng)24h后觀察檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上有無細(xì)菌生長并觀察其顏色變化。若變?yōu)樗{(lán)色則為陽性，若仍呈綠色為陰性。2.5生化結(jié)果判定2.5.1．靛基質(zhì)試驗（吲哚試驗）取出試管（蛋白胨水）→乙醚1ml，振蕩，靜置，待分層后→沿管壁加入對二甲基氨基苯甲醛3-5滴，在分界處出現(xiàn)紅色玫瑰吲哚為陽性。2.5.2．葡萄糖蛋白胨水一分為二（1）甲基紅（MR）試驗：取出試管→加入甲基紅3-5滴，搖勻，培養(yǎng)基變紅色為陽性，不變色為陰性（2）VP試驗：取出試管→VP甲液0.6ml，搖勻→再加VP乙液0.2ml，15min后看結(jié)果，變紅為陽性，不變?yōu)殛幮�，橙色為結(jié)果不可信，需重做。靛基質(zhì)試驗(吲哚試驗)原理：細(xì)菌若含有色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與試劑對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基質(zhì)。培養(yǎng)基：蛋白胨水試劑：靛基質(zhì)試劑（含對二甲基氨基苯甲醛）結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基出現(xiàn)紅色液面：+培養(yǎng)基液面為黃色：－應(yīng)用：用于腸道桿菌的鑒定甲基紅試驗原理：細(xì)菌分解糖，產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步生成大量混合酸，使培養(yǎng)基pH維持在4.4以下，加入甲基紅后，使甲基紅呈現(xiàn)紅色反應(yīng)。此為甲基紅試驗陽性。培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水試劑：甲基紅試劑(pH4.2紅色-pH6.3黃色）結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色：+培養(yǎng)基不變色：－應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌V-P試驗原理：細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中乙酰甲基甲醇被氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基結(jié)合，生成紅色化合物。培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色：+培養(yǎng)基不變色：－應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌。細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果記錄表三糖鐵糖發(fā)酵斜底硫氫沙門紅黃+葡萄糖-乳糖麥芽糖+甘露醇-+--+-蔗糖面層化甲基紅VP試驗吲哚硫化氫脲枸酶櫞酸鹽+總之，通過這幾個月的實習(xí)，我收獲了很多的理論知識的同時，也收獲了很多的實踐經(jīng)驗，本次實習(xí)，我認(rèn)真努力的完成老師的安排，雖然有些實驗結(jié)果不是令人很滿意，但我在劉文華老師的指點下分析自身的原因和其他的一些因素，找出自己的不足，和產(chǎn)生錯誤的原因。使我收獲了很多實驗技能，在實驗過程中，我深刻的認(rèn)識到了自己掌握知識的局限，在以后的生活中，我會在努力用理論武裝自己的同時，把握機會提升自己的實踐技能，爭取取得更大的進(jìn)步。最后特別感謝在這次實習(xí)中，一直指導(dǎo)我們的老師，同時誠摯的感謝師哥以及實驗室的其他師哥師姐。因為他們我學(xué)到了很多的實驗技能和專業(yè)知識，使自己取得了一定的進(jìn)步實習(xí)總結(jié)成績

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一．實習(xí)目的

為了使學(xué)生能夠理論聯(lián)系實際，通過親自實地解剖感染小鼠，對小鼠的心、肝、脾進(jìn)行麥康凱瓊脂平板劃線培養(yǎng)，以柯赫法則為這次實習(xí)的主線，達(dá)到鑒定出小鼠感染的菌種的目的，熟練運用微生物實驗課的所涉及的實驗操作和方法，提高實驗動手能力，分析實驗過程中可能出現(xiàn)的問題，并解決問題。特開設(shè)微生物教學(xué)實習(xí)，掌握基本技能，加深理論部分的理解，能夠獨立診斷出傳染病病菌，獲得嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)實驗素養(yǎng)。

二．實習(xí)材料

實驗動物：一只被感染小鼠，一只健康小鼠

實驗器械，主要包括：小鼠解剖工具手術(shù)剪、鑷子、蠟盤、釘子，接種棒、酒精燈、打火機、記號筆、手套、載玻片、槍頭、注射器、離心管。

實驗材料：麥康凱瓊脂平板、各種染色液（結(jié)晶紫溶液、碘溶液、酒精、沙黃水）、蒸餾水、培養(yǎng)基（普通肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基）、PBS重懸液、生化試驗材料（微量發(fā)酵管（葡、乳、枸、尿素、麥、甘醇、蔗、硫）、對二甲基氨基苯甲醛、乙醚、甲基紅、vp甲乙液）。

實驗主要儀器：離心機，分光光度器，溫箱，搖床，超凈工作臺

三．實習(xí)內(nèi)容

以柯赫法則為主線，通過對感染小鼠的剖解采樣、分離培養(yǎng)、鏡檢、擴增培養(yǎng)，然后把得到的純培養(yǎng)物對健康小鼠進(jìn)行再次接種以獲得被感染小鼠，再次重復(fù)以上操作，把獲得的純培養(yǎng)物通過鏡檢觀察和做生化實驗來鑒定出感染小鼠的致病菌。

四．實習(xí)操作進(jìn)程

第一天：實驗設(shè)計、討論癥狀、分離剖解

1實驗設(shè)計：以小組為單位進(jìn)行實驗設(shè)計，明確此次實驗主要法則是：柯赫法則。在老師的指導(dǎo)下確定此次實習(xí)的主要步驟，討論實驗中可能遇到的問題以及注意事項。

2討論癥狀：比較觀察健康小鼠與病鼠，可見到病鼠一般呈萎靡狀，不活躍。每組領(lǐng)取一只感染小鼠觀察癥狀，體表基本正常。

3分離剖解：先將麥康凱瓊脂平板分三區(qū)，依次寫上肝、脾、心。右手抓起小鼠尾巴，將小鼠搖暈，采用頸椎脫臼法將小鼠處死。將小鼠尸體仰臥固定于蠟盤上，充分露出胸腹部。先用小鼠腹部柔軟部用剪刀剪一小口，然后從該小口處往上、往下剪將皮毛剝離，剝離腹膜暴露出肝臟和脾，可觀察到有輕微的肝腫脹，顏色變淡。將肝和脾切開一小口，用接種環(huán)取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行劃線分離。再打開胸腔觀察，可見胸腔有出血現(xiàn)象和凝血塊，剪開心包膜，將心臟切一小口，用接種環(huán)取樣，在麥康凱瓊脂平板的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行劃線分離。寫上班級組別，日期，置于溫箱中培養(yǎng)至第二天早上8點。

第二天：挑取單菌落，鏡檢，擴增培養(yǎng)，重懸，測OD配濃度，小鼠腹腔注射

1挑取單菌落：觀察麥康凱瓊脂平板上菌落的形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面光滑，暗紅色，圓心處顏色較邊緣淺。挑去單個菌落，畫上記號準(zhǔn)備做后續(xù)試驗。

2鏡檢：選取所挑選菌落的一半進(jìn)行抹片。取干凈玻片，滴半滴去離子水，用接種環(huán)挑取菌進(jìn)行抹片、干燥固定、采用格蘭染色法染色：草酸銨結(jié)晶紫染色1-2’，水洗，革蘭氏碘液媒染1-2’，水洗，95%酒精脫色約30’’-1’，水洗，沙黃水溶液復(fù)染10’’-30’’，水洗。吸干，鏡檢。觀察到該菌被染成紅色，是格蘭陰性菌。3擴增培養(yǎng)：選取剩余的菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，置于溫箱培養(yǎng)9個小時至菌的生長對數(shù)期。4重懸測OD值配濃度：下午5點左右，將培養(yǎng)的菌轉(zhuǎn)入無菌小管中離心，離心后可見菌沉于管底，在超凈工作臺內(nèi)操作，去上清液，用槍頭吸取PBS液至去了上清液的菌管中，反復(fù)吹打使其重懸，然后再次離心，去上清，重懸，通過分光光度計測得OD590的值，配成2*10^7CFU濃度的菌液。

5小鼠腹腔注射：每組挑選一只健康小鼠，在頭部或尾部做上記號，用右手抓住鼠尾，將其搖暈

，令其前爪抓住鐵絲蓋上，然后用左手的拇指和食指捏住小鼠頭頸部皮膚，并翻轉(zhuǎn)左后使其腹部朝上，將其尾巴夾在左手掌與小指之間，右手把持注射器吸取2mL菌液，在股后側(cè)面插入針頭，先刺入皮下，后進(jìn)入腹腔，注射時阻力，皮膚也無泡隆起。注射完將小鼠放回鼠籠即可。

第三天：觀察小鼠發(fā)病情況

小組成員分時間段觀察小鼠感染情況，見小鼠瀕死的盡快解剖接種分離致病菌。若一整天未見小鼠有異常情況的等第二天解剖

第四天：剖解劃線培養(yǎng)

雖然小鼠未見萎靡，由于預(yù)訂的感染時間差不多，可以進(jìn)行解剖接種第一天的操作，可見體表有淤血點，剖開的小鼠肝臟流出大量的血液。其余均同第一天的操作，將麥康凱瓊脂平板的上所接的菌置于溫箱中培養(yǎng)。

第五天：生化鑒定

觀察到平板上只有一個較小的暗紅色菌落，挑取該菌落進(jìn)行擴增培養(yǎng)9小時至細(xì)菌生長的對數(shù)期。下午6點觀察，培養(yǎng)液依舊是澄清的，很可能沒有長菌。為做進(jìn)一步的驗證，進(jìn)行生化試驗。將該菌接入微量發(fā)酵管（）和蛋白胨以及葡萄糖蛋白胨中，培養(yǎng)至第二天看結(jié)果。

第六天：觀察結(jié)果，整理報告

生化試驗無任何反應(yīng)，說明接的菌為雜菌或污物，整理實驗報告并分析失敗原因。

六．實驗結(jié)果與分析

此次試驗失敗

給小鼠攻毒，未能分離出致病菌，因此也無法鑒定出小鼠被感染的病原菌為何種腸桿菌科

試驗失敗原因可能有：

1、接種棒火焰消毒后，等待冷卻的時間過短，接種棒接種菌時將菌燙死2、由于小鼠的免疫力強，使得感染小鼠的病原菌被免疫掉了，因此未接種到治病菌3.給小鼠注射的量或濃度還不夠未能達(dá)到使小鼠感染的目的

4、在第一次從小鼠體內(nèi)分離出來的菌可能不是致病菌，或者麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)出來的菌落不止一種，而我們挑選到的某一菌落恰好不是致病菌。

5、在進(jìn)行腹腔注射時，可能沒有注射到腹腔，而只注射到皮下，或者其它部位。6、采樣時可能由于接種環(huán)未完全伸入到心、肝、脾的組織中，或者伸到的組織里恰好沒有致病菌

7、可能由于小鼠感染的時間過短，還未達(dá)到菌生長曲線的高峰期

七．思考與總結(jié)

1此次試驗失敗的原因有很多在我看來最有可能的原因有以下幾點：

（1）小鼠免疫:由于這些小鼠是實驗室的小鼠，長期被用來做各種致病菌的實驗，使得它們獲得一定的免疫，所以雖然注射了足夠使小鼠感染發(fā)病的劑量，但也被小鼠免疫掉了，而無法從小鼠體內(nèi)獲得病料。（2）病料不夠：從學(xué)姐那了解到，她們做攻毒實驗的動物，都是將整個組織塊磨碎以后，

再接到培養(yǎng)基上，而我們做實驗是只是用接種棒挑取一點，接種棒上粘到的病料比較少或根

本沒有，因此培養(yǎng)不出菌。

（3）挑取的單菌落未必是致病菌：由于平板上長出可能不止一種菌，因此挑到的單菌落，未必是致病菌。

2為什么擴增出來的菌不直接注射小鼠，而要經(jīng)過離心？因為菌可能會產(chǎn)生毒素，若直接注射可能就無法判斷使小鼠發(fā)病的到底是毒素作用，還是因為病菌在小鼠體內(nèi)繁殖感染而造成的。3腸桿菌科有哪些，特征有哪些？學(xué)生自我鑒定：

201*年5月16號到21號期間進(jìn)行了維持一周的微生物實習(xí)，在微生物實習(xí)期間，我能夠做到主動和小組成員交流、合作、解決問題，認(rèn)真完成實驗操作，學(xué)會靈活運用自己的專業(yè)知識解決問題。

通過這段時期的實習(xí)，我們對無菌操作有了進(jìn)一步的理解，掌握了儀器操作的基本技能，鞏固了理論部分的知識，也了解到公共衛(wèi)生意識的重要性。實習(xí)不過短短的五天，在這短暫的五天內(nèi)，，我們有過發(fā)現(xiàn)時的喜悅，有過解剖小鼠時的緊張，有過培養(yǎng)不出菌時的困惑，但最終我們收獲了知識，也收獲了友誼，在合作中共同進(jìn)步，在困難中共同進(jìn)退，一切的困難便能迎刃而解。

這次微生物實習(xí)為我們專業(yè)的繼續(xù)拓展提供了寶貴的經(jīng)驗，為動物醫(yī)學(xué)本科專業(yè)的我們學(xué)習(xí)后續(xù)課程奠定扎實的基礎(chǔ)。

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