小學(xué)教師教研工作總結(jié)張富

小學(xué)教師教研工作總結(jié)

一期來，我兢兢業(yè)業(yè)，踏踏實(shí)實(shí)，根據(jù)期初的教學(xué)工作計(jì)劃，以新課程改革為契機(jī)，以新課程標(biāo)準(zhǔn)的基本理念為指導(dǎo)，轉(zhuǎn)變教學(xué)觀念，有目的，有計(jì)劃，有步驟地進(jìn)行課程改革。本著科研先導(dǎo)，以研促教，教為學(xué)服務(wù)的研究宗旨，堅(jiān)持不懈地抓住新課程改革這一契機(jī)，有條不紊的開展各項(xiàng)教學(xué)教研活動(dòng)，順利地完成了本學(xué)期的教育教研任務(wù)，實(shí)現(xiàn)了學(xué)期初制定的教學(xué)目標(biāo)。為了更好地完成今后教育教研工作，使教學(xué)工作做到有的放矢，特對(duì)本學(xué)期的教研工作總結(jié)如下：

一、制訂切實(shí)可行的教研計(jì)劃

為了做好本期的教研工作，有的放矢，我們開學(xué)伊始，計(jì)劃先行。我根據(jù)教育教學(xué)現(xiàn)狀，認(rèn)認(rèn)真真地權(quán)衡利弊，制訂出切實(shí)可行的教研計(jì)劃。二、狠抓有效課堂教學(xué)

根據(jù)縣教研室的要求和我班的教育教學(xué)現(xiàn)狀，采取有效措施狠抓有效課堂教學(xué)。領(lǐng)會(huì)新大綱和新課程標(biāo)準(zhǔn)的精神實(shí)質(zhì)把握教材的特點(diǎn)，制定出切實(shí)可行的教學(xué)工作計(jì)劃。做到集體備課與獨(dú)立備課相結(jié)合，高標(biāo)準(zhǔn)地完成單元備課和課時(shí)備課，及時(shí)對(duì)全冊(cè)教材進(jìn)行集體教研和教學(xué)方法的探討，明確教學(xué)思路。積極參加各種教研活動(dòng)，觀摩學(xué)習(xí)，及時(shí)進(jìn)行了教研探討，并把學(xué)習(xí)到的教育新理念運(yùn)用到自身的教學(xué)活動(dòng)中，做到本校互聽、校際交流、外出觀摩，做到聽課不少于20節(jié)。三開展活動(dòng)促教學(xué)

為了全面提高素質(zhì)教育，讓教師和學(xué)生都有所發(fā)展，我積極參加各種教研活動(dòng)。本期參加的教育教研活動(dòng)主要有：校際教研交流活動(dòng)、電化教學(xué)公開課、作文改革公開課、復(fù)習(xí)研討課、語(yǔ)文青年教師比武課、有效課堂送下村、還舉行了三年級(jí)學(xué)生語(yǔ)文知識(shí)綜合競(jìng)賽、小學(xué)生讀書活動(dòng)演講，從多方面開展素質(zhì)教育。四、抓常規(guī)保質(zhì)量

為盡可能地提高教育教學(xué)質(zhì)量，我從教學(xué)計(jì)劃到備課到上課到課后反思、批改作業(yè)、校本培訓(xùn)都進(jìn)行了具體的實(shí)施。段考后對(duì)自己進(jìn)行一次教學(xué)常規(guī)檢查。

五、加強(qiáng)學(xué)習(xí)提高自身素質(zhì)

學(xué)無止境，為自己能更好地為教育服務(wù)，展現(xiàn)教師的人生價(jià)值，我常常教導(dǎo)自己要有終身學(xué)習(xí)的觀念，平時(shí)多讀書看報(bào)，有機(jī)會(huì)多學(xué)習(xí)取經(jīng)，鼓勵(lì)自己

多寫心得體會(huì)、教學(xué)所見所感、教育教學(xué)論文，不斷地提高自身素質(zhì)。

擴(kuò)展閱讀：12484040 張富

編號(hào)（學(xué)號(hào)）：12484040

畢業(yè)論文

（201*屆本科）

題目：小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進(jìn)化分析學(xué)院：生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院專業(yè)：生物技術(shù)姓名：張富指導(dǎo)教師：郭志富完成日期：201*年06月08日

畢業(yè)論文任務(wù)書

論文題目學(xué)生姓名下發(fā)任務(wù)小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進(jìn)化分析日期張富指導(dǎo)教師201*年6月郭志富一.論文主要內(nèi)容根據(jù)已有小麥近緣屬種重結(jié)晶抑制蛋白基因（IRI），設(shè)計(jì)引物，對(duì)小麥野生近緣屬種山羊草、偃麥草、Thinopyrumpycnanthum等IRI基因進(jìn)行克隆、測(cè)序鑒定以及不同種屬的IRI基因進(jìn)行彼此的差異化分析、進(jìn)化分析，達(dá)到對(duì)IRI基因的全面的分析，為今后挑選抗凍性最強(qiáng)的IRI基因轉(zhuǎn)移道小麥品種等作物中從而提高其抗凍性奠定理論基礎(chǔ)。二.論文的基本要求1、學(xué)習(xí)掌握生物學(xué)文獻(xiàn)的檢索技能，查閱相關(guān)資料，撰寫文獻(xiàn)綜述。2、掌握組培技術(shù)、DNA提取實(shí)驗(yàn)技術(shù)及NCBIBLAST的使用。3、熟練使用引物設(shè)計(jì)軟件，操作PCR儀和連接、克隆、多序列分析。4、能夠通過自己設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)，撰寫畢業(yè)論文，不少于10000字。5、能熟練閱讀與實(shí)驗(yàn)相關(guān)的中、英文文獻(xiàn)。

三.論文工作進(jìn)度安排階段123456備注：四.應(yīng)收集的資料及主要參考文獻(xiàn)（指導(dǎo)教師指定）1.周筱娟.低溫誘導(dǎo)的植物抗凍基因研究進(jìn)展[J].紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào).第24卷第9期201*年9月2.NovilloF。AlonmJM．ColdacclimationofArabidopaisthalLana：Affectonplasmamembranelipidcompositionandefreeze-inducedlesions[J]．PlantBiology，201*(11)139853990．3.SteponkusPLRoleofplamaamembraneincoldacclimationandfreezinginJuryInplants．Amlu.Rev[J]．PlantPhysi01．1984．35：543584．4.HughesMA，DunnMA．Themolecularbiologyofplantacclimationtolowtemperature．JExpBot，1996，47：29l8055.GibsonS，ArondelV．Cloningofatemperatureregulatedgeneencodingachloroplastω-3desaturasefromArabidopsisthaliana.PlantPhvsiol。1994，106：1615～162l6.Liansenliu,MichaeJ.White,ThornasH.MacRae.Eur.JBiochem.1999,262,247~2577.黃文功.殷奎德.高中超-植物抗凍基因工程研究進(jìn)展生物技術(shù)通報(bào)，201*年第2期8.劉曉丹.李海燕-CBF轉(zhuǎn)錄因子在提高植物抗逆性中的作用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)。JournalofAnhuiAgri．5ci．201*．37{32}：1574915751論文各階段名稱閱讀文獻(xiàn)，查找相關(guān)資料實(shí)驗(yàn)所需材料的整理材料DNA提取PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序處理數(shù)據(jù)、分析結(jié)果畢業(yè)論文成稿日期201*.06201*.06201*.06201*.06201*.12201*.01201*.05201*.05201*.

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文選題審批表

選題名稱學(xué)號(hào)小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進(jìn)化分析姓名郭志富張富專業(yè)職稱題目來源教師擬定（b）生物技術(shù)講師12484040指導(dǎo)教師對(duì)偃麥草屬、山羊草屬、冰草、黑麥草屬等小麥野生近緣屬種材料提取DNA，利用研NCBI已有小麥屬IRI蛋白基因同源引物克隆新的IRI基因，并連接到載體上，轉(zhuǎn)化大腸究桿菌后進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化分析。內(nèi)容論文題目選定，資料查閱；準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料及試劑藥品；進(jìn)行前期準(zhǔn)備工作；研究提取材料DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收、克隆測(cè)序；計(jì)數(shù)據(jù)分析處理；劃撰寫論文。本實(shí)驗(yàn)在集中于發(fā)現(xiàn)多個(gè)小麥近緣屬種中的IRI基因，并進(jìn)行了不同品種間IRI基特因序列差異性分析和分子進(jìn)化分析。為挑選、鑒定抗凍性最強(qiáng)的IRI基因的篩選以及后色續(xù)的轉(zhuǎn)基因的工作奠定理論基礎(chǔ)。指導(dǎo)教師意見教研室意見學(xué)院意見

畢業(yè)論文指導(dǎo)記錄

學(xué)生姓名指導(dǎo)教師姓名論文題目時(shí)間學(xué)生簽字：年月日指導(dǎo)教師簽字：年月日教研室主任簽字：年月日張富郭志富專業(yè)職稱講師生物技術(shù)本年度指導(dǎo)畢業(yè)生人數(shù)5小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進(jìn)化分析地點(diǎn)指導(dǎo)內(nèi)容

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文考核表

論文題目：小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進(jìn)化分析姓名：張富學(xué)號(hào)：12484040專業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師評(píng)語(yǔ)：指導(dǎo)教師（簽字）：年月日評(píng)閱人評(píng)審意見：評(píng)閱人（簽字）：年月日答辯委員會(huì)意見：成績(jī)：主任委員（簽字）：年月日

目錄

摘要.............................................................................................................................................................1Abstract...........................................................................................................................................................2前言.............................................................................................................................................................31.IRI蛋白的研究概述...................................................................................................................................3

1.1抗凍蛋白（AFPs）的特性.............................................................................................................41.2植物AFPs發(fā)現(xiàn)...............................................................................................................................41.3植物IRI蛋白的理化性質(zhì)及特征...................................................................................................41.4植物AFPs的結(jié)構(gòu)模型特征...........................................................................................................51.5抗凍蛋白的作用機(jī)理......................................................................................................................61.6AFPs的研究意義和應(yīng)用.................................................................................................................61.7植物AFPs的研究現(xiàn)狀...................................................................................................................72.材料、試劑................................................................................................................................................9

2.1材料及處理......................................................................................................................................92.2菌株與載體......................................................................................................................................92.3酶與試劑.........................................................................................................................................92.4實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器及生物軟件............................................................................................................102.5相關(guān)試劑的配制............................................................................................................................103.實(shí)驗(yàn)方法與步驟......................................................................................................................................12

3.1植物基因組DNA的提�。ㄖ参锘�因組DNA提取試劑盒）...................................................123.2IRI基因的PCR擴(kuò)增.....................................................................................................................123.3目的片段與載體連接....................................................................................................................133.4轉(zhuǎn)化................................................................................................................................................143.5陽(yáng)性克隆：藍(lán)白斑篩選................................................................................................................143.6菌落PCR.......................................................................................................................................143.7搖菌測(cè)序........................................................................................................................................154．實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析.....................................................................................................................................15

4.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)....................................................................................................154.2測(cè)序結(jié)果及分析............................................................................................................................164.3測(cè)序結(jié)果的DNA多序列比多和氨基酸序列比對(duì)分析..............................................................174.4IRI的進(jìn)化分析...............................................................................................................................205．討論.....................................................................................................................................................23參考文獻(xiàn).......................................................................................................................................................25致謝.........................................................................................................................................................27

":null,"page":{"ph":1262.879,"pw":892.979,"v":6,"t":"1","pptlike":null,"cx":0,"cy":0,"cw":892.979,"ch":1262.879}})沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文

摘要

小麥野生近緣屬種中蘊(yùn)含豐富的抗性資源，是小麥遺傳改良的天然基因庫(kù)。重結(jié)晶抑制蛋白(IceRecrystallizationInhibitionprotein，IRI)能結(jié)合于冰晶表面阻止冰晶生長(zhǎng)，從而提高植物抗寒能力。在小麥野生近緣屬種中廣泛分離IRI基因，并對(duì)其進(jìn)行功能分析，對(duì)后續(xù)篩選優(yōu)勢(shì)IRI基因轉(zhuǎn)入到小麥等作物品種從而提高抗寒力具有重要意義。本文主要研究結(jié)果如下：

(1)在5個(gè)小麥野生近緣屬材料中，克隆得到編號(hào)為B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21共8個(gè)序列具有典型IRI基因的保守區(qū)特征，同時(shí)在氨基酸組成上存在一定的結(jié)構(gòu)差異。(2)在所得IRI基因中，DNA序列最短的為849bp，最長(zhǎng)為864bp，其中B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25編碼的氨基酸總數(shù)分別為287、283、286、288、284、285、288、284。(3)B24和W25基因末端由于堿基的缺失，導(dǎo)致移碼突變，使得后續(xù)氨基酸突變，該突變可能引起IRI蛋白的功能的改變。

(4)B25基因編碼的半胱氨酸只有3個(gè)，為奇數(shù)個(gè)，而其余的7個(gè)基因編碼的半胱氨酸均為4個(gè)，是偶數(shù)個(gè)。該氨基酸的突變是由于單堿基置換引起的，推測(cè)可能會(huì)影響IRI蛋白的功能。

(5)進(jìn)化分析表明，不同材料中克隆出的IRI基因親緣關(guān)系可能比同一材料中的更近，說明IRI基因家族存在較為豐富的變異，推測(cè)可能是在植物長(zhǎng)期進(jìn)化過程中不斷適應(yīng)低溫變化而調(diào)整自身基因結(jié)構(gòu)從而適應(yīng)低溫環(huán)境的原因。

關(guān)鍵詞：重結(jié)晶抑制蛋白；低溫；抗凍蛋白；小麥野生近緣屬種；克��；進(jìn)化分析

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

Abstract

Thewildrelativesofwheatarespeciescontainsrichresourcesofresistanceisthenaturalgenepoolforwheatimprovement.Recrystallizationinhibitionprotein(IceRecrystallizationInhibitionprotein,IRI)cancombinetopreventthegrowthoficecrystalsintheicesurface,therebyimprovingplantcoldtolerance.IRIgeneinthewildrelativesofwheatspecieswidelyseparated,andfunctionalanalysis,andfollow-upscreeningadvantageIRIgeneintothewheat,andothercropvarieties,therebyenhancingthecoldhardinessofgreatsignificance.

Inthispaper,resultsareasfollows:

(1)infivewildrelativesofwheatmetallicmaterials,theclonednumberB2A,B2B,B15C,B24,B25,W15,W17,W218sequencestypicalIRIgenesconservedregioncharacteristics,whileintheaminoacidcompositiontherearesomestructuraldifferences.

(2)theproceedsofIRIgenes,DNAsequencesaretheshortest849bp,upto864bp,ofwhichthetotalnumberofB2A,B2B,B15C,B24,B25,W15,W17,W25-encodedaminoacidswere287,283,286,288,284,285,288,284.

(3)theendoftheB24andW25genebasedeletion,resultinginframeshiftmutation,makingthesubsequentaminoacidmutations,themutationsmaycausefunctionalchangesofIRIprotein.

(4)B25geneencodingthecysteine3isanoddnumber,whiletheremainingsevengenesencodingcysteineare4,isanevennumber.Theaminoacidmutationsarecausedbysinglebasesubstitutions,suggestingthatmayaffectthefunctionoftheIRIprotein.

(5)ThephylogeneticanalysisshowedthatclonedindifferentmaterialsIRIgenephylogeneticrelationshipmaybecloserthaninthesamematerial,indicatingthattheIRIgenefamilythereismorevariation,andspeculatedthatitmightcontinueinthelong-termevolutionaryprocessofplantadaptationtolowtemperaturechangesadjustitsgenestructuretoadapttothereasonsofthelow-temperatureenvironment.

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沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文

前言

植物在為了適應(yīng)環(huán)境而進(jìn)化出不同的抗性條件。植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，溫度作為一個(gè)重要的環(huán)境因子對(duì)其生長(zhǎng)、生殖和分布起著關(guān)鍵的作用。溫度的不同導(dǎo)致植物在不同地區(qū)分布不同的主要原因之一，低溫不僅在很大程度上限制植物的種植范圍，同時(shí)還會(huì)造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。根據(jù)植物對(duì)低溫的反應(yīng)差異，可以將植物簡(jiǎn)要分為兩類：一類是耐寒能力弱或不能耐寒的植物，也稱冷敏感植物；另一類是抗寒植物，也稱冷不敏感植物。不抗寒植物主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，10～12℃的非冰凍低溫即可引起對(duì)植物生命活動(dòng)的傷害，而抗寒植物生長(zhǎng)于溫帶、寒帶地區(qū)，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了低溫相應(yīng)的抵抗能力，但在不同植物之間抗寒能力強(qiáng)弱上存在差異[1，2]。

就小麥這一品種作物而言，生長(zhǎng)在我國(guó)南方的小麥和生長(zhǎng)在我國(guó)北方的小麥表現(xiàn)了不同差異。南方的小麥處于溫和的地區(qū)，沒有低溫寒害的環(huán)境，小麥存活而產(chǎn)量高。相比較而言，北方的小麥耐寒的能力相對(duì)較強(qiáng)，但是依舊會(huì)面著驟降低溫寒害。但是，由于南方的小麥不具抗寒能力，將南方的小麥移植到北方從而提高北方小麥的產(chǎn)量的想法卻沒有成功，此外，北方的的小麥的抗寒能力也有限。小麥?zhǔn)侨�球種植總產(chǎn)量第二的糧食作物，僅次于玉米，每年因?yàn)榈蜏睾�害而造成的小麥損失達(dá)數(shù)千億美元，所以提高小麥的抗寒能力尤為重要。所以，通過研究小麥野生近緣屬種植物中抗寒能力最強(qiáng)的植物，將其對(duì)抗寒能力起著重要作用的的相關(guān)基因克隆出來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移到小麥等相關(guān)的作物中提高作物的抗寒能力，免受或降低低溫的損害從而提高小麥的產(chǎn)量相當(dāng)重要。

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，植物形成的抗凍蛋白具有抗凍、抗病雙重功能。植物抗凍蛋白提高植物抗凍性的主要途徑不是阻止冰晶的形成，而是調(diào)控胞外冰晶的增長(zhǎng)及抑制冰的重結(jié)晶，避免冰晶增大而產(chǎn)生致死性的機(jī)械損傷[3,4]．IRI蛋白是具有重結(jié)晶抑制活性的AFP蛋白，主要分布于南北回歸線以外高緯度地區(qū)以及高山高寒區(qū)，常見的有高山雪蓮、胡蘿卜[5]、黑麥草[6]、沙生冰草[7]、沙冬青[8]等，它們共同的特點(diǎn)是都經(jīng)過冷誘導(dǎo)，IRI蛋白表達(dá)從而提高植物的抗寒性。

1.IRI蛋白的研究概述

抗凍蛋白(antifreezeproteins，AFPs)是1969年Devrjes在南極Mcmurdo海峽的一種Nototheniid魚的血液中首次發(fā)現(xiàn)的，它是生物體在受凍害脅迫時(shí)產(chǎn)生并籍此防止細(xì)胞免受冰凍傷害．AFPs已經(jīng)在多種冰凍耐受機(jī)體中發(fā)現(xiàn)，包括魚類、昆蟲、陸生節(jié)肢動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和植物．其中，有關(guān)植物AFPs的研究起步較晚，20世紀(jì)90年代初

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

期才開始研究植物中的AFPs．近年來，AFPs的研究已取得重大進(jìn)展，成為生命科學(xué)中較為活躍而且發(fā)展迅速的課題之一．

1.1抗凍蛋白（AFPs）的特性

抗凍蛋白是一類抑制冰晶生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)影響甚微，于是導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)(meltingpoint，MP)和冰點(diǎn)(freezingpoint，F(xiàn)P)之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性(thermalhysteresisactivity，THA)，因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(thermalhysteresisproteins，THPs)。AFPs從發(fā)現(xiàn)至今，有兩個(gè)特性，其中之一是產(chǎn)生熱滯效應(yīng)．一般溶液(如Nacl，蔗糖溶液等)的冰點(diǎn)是固、液兩相蒸氣壓平衡時(shí)的溫度，因而冰點(diǎn)應(yīng)等于熔點(diǎn)．但是AFPs這類大分子只影響結(jié)冰過程，幾乎不影響熔化過程，使冰點(diǎn)低于熔點(diǎn)，這種現(xiàn)象叫做熱滯效應(yīng)．熱滯是一種非理想溶液的行為，AFPs的冰點(diǎn)不由溶液的依數(shù)性決定，而它的熔點(diǎn)卻由溶液的依數(shù)性決定，使二者出現(xiàn)差值，冰點(diǎn)和熔點(diǎn)的差值稱為熱滯值[10]．AFPs的另一個(gè)特性是抑制冰晶的重結(jié)晶，AFPs通過抑制冰晶的重晶化，防止小的冰晶結(jié)成更大的冰晶，使形成的冰晶小且均勻．因此，它可以減輕冰晶在凍融的動(dòng)態(tài)變化中對(duì)生物體的傷害．AFPs的上述特性都是通過AFPs與冰晶的表面相互作用而實(shí)現(xiàn)的。以上兩個(gè)特性可作為判定AFPs的依據(jù)。

[9]

1.2植物AFPs發(fā)現(xiàn)

Griffithetal.[11]1992年第一次明確提出已經(jīng)獲得植物植物內(nèi)源AFPs，從經(jīng)低溫有道忍受細(xì)胞外結(jié)冰的冬黑麥(SecalecerealeL．)葉片質(zhì)外體中得到并部分純化了該蛋白，Dumanetal．[12]多種植物中發(fā)現(xiàn)了具有熱滯效應(yīng)的蛋白質(zhì)，并從千年不爛心(Solanumdulcamara)的冬季枝條中分離到分子量為67kD的抗凍糖蛋白[13]。1994年，費(fèi)云標(biāo)等[14]從強(qiáng)抗凍植物沙冬青(Ammopiptanthusmonglicus)葉片中發(fā)現(xiàn)AFPs,隨后，越來越多的抗凍蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)。

1.3植物IRI蛋白的理化性質(zhì)及特征

Griffithetal.[11]于1992年從冬黑麥(SecalecerealeL．)的質(zhì)外體中分離和純化了AFPs的研究表明冬黑麥的AFPs包括7個(gè)AFPs(分子量從1l～36kD)，這些蛋白存在著彼此的相似氨基酸組成，均富含Asp／Asn，Glu／Gln，ser，Thr，Gly，Ala，均缺少His，Cys含量達(dá)5％以上．而且Western印跡分析表明，植物冬黑麥的AFPs同魚及昆蟲富含Cys的AFPs沒有共同的抗原決定簇．1994年費(fèi)云標(biāo)等[14]從強(qiáng)抗凍植物沙

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沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文

冬青(Ammopiptanthsumongolicus）中發(fā)現(xiàn)AFPs，接著他們從沙冬青葉片中分理出AFPs，其中一種為熱穩(wěn)定的抗凍糖蛋白AFPs，分子量為40kD，熱滯活性為0．9℃(20mgmL-1)，和其它AFPs進(jìn)行比較，沒有發(fā)現(xiàn)相同的類型，測(cè)定其N一端20個(gè)氨基酸為SDDLLFNKFVPCQTDILF，表明它與植物凝集素具有同源性[15]．另外3種不是糖蛋白，它們分別為：分子量67kD，熱滯活性O(shè)．46℃(8mgmL-1)，分子量2lkD．熱滯活性0。46℃(8mgmL-1)分子量39．8kD．熱滯活性0．45℃(10mgmL-1)[16]．Sidebottometal[17]從一種越冬的多年生黑麥草(Loliumperenne)中發(fā)現(xiàn)了一種熱穩(wěn)定性的AFPs，這種蛋白由118個(gè)氨基酸組成，100℃時(shí)仍穩(wěn)定存在，熱滯效相對(duì)較低，但對(duì)球晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)是魚的AFPs(TypⅢ)的200倍．因此，在低溫條件下，推測(cè)冬麥草AFPs的重結(jié)晶抑制效應(yīng)可能是細(xì)胞避免冰凍損傷的重要生理基礎(chǔ)．

綜合已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物AFPs，發(fā)現(xiàn)具有以下特點(diǎn)：

(1)不同植物的AFPs的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上差別很大，表現(xiàn)在氨基酸序列相似性低。雖然其在DNA和氨基酸水平上完全不同(幾乎沒有同源性)但卻擁有相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)，冰晶結(jié)合位點(diǎn)也有一定的相似性。而且都可以通過表面互補(bǔ)模型較好地解釋它們與冰晶之間的相互作用,但植物的AFPs表面互補(bǔ)模型也存在很多問題(如至今還無法確定表面互補(bǔ)模型中到底含有多少種作用力的存在），每種作用力的貢獻(xiàn)程度和作用方式更是需要進(jìn)一步的研究[18，19]。現(xiàn)在一般認(rèn)為范德華力和疏水作用可能起著主要的作用，氫鍵起著輔助的作用。

(2)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物AFPs不僅僅只具有抗凍活性，還存在酶功能(如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶[18]，內(nèi)切β-1，3葡聚糖酶)，抗菌功能(如甜味蛋白等)和抗蟲功能(植物凝集素)，抗旱功能(植物脫水素)等活性；

(3)總體上已發(fā)現(xiàn)的大部分植物AFPs的熱滯活性都大大低于魚類和昆蟲AFPs的熱滯活性，但也有例外，有些植物(如黑麥草)的AFPs的冰晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于魚類和昆蟲AFPs，表明了植物AFPs存在的多樣性。所以，推測(cè)植物AFPs提高本身的抗凍性的主要途徑不是通過阻止冰晶形成，而是通過控制冰晶增長(zhǎng)和抑制冰晶重結(jié)晶效應(yīng)；

(4)植物的AFPs表達(dá)除了被低溫誘導(dǎo)外，還能被其它外因影響，如干旱[19]，外源乙烯

[20]

(可誘導(dǎo)冬黑麥的AFPs)，脫落酸

[21]

等也可誘導(dǎo)植物AFPs的產(chǎn)生。推測(cè)植物的AFPs

可能還有其它方面的功能。

1.4植物AFPs的結(jié)構(gòu)模型特征

由于最初發(fā)現(xiàn)的AFPs來自魚類，所以有關(guān)魚類AFPs的結(jié)構(gòu)模型的研究較多，但是與植物相關(guān)的的AFPs研究相對(duì)較晚，而且植物的AFPs存在較大的差異性，所以植物相關(guān)的AFPs研究較少。201*年Kuiperetal.[22]在研究多年生黑麥草的AFPs的中發(fā)現(xiàn)

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

其抑制活性高，熱滯活性低，而且其一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有重復(fù)性的序列。他們從理論提出了一種三維結(jié)構(gòu)模型：在獲得的包含個(gè)118個(gè)氨基酸的AFPs的多肽中，每14～15個(gè)氨基酸組成一個(gè)環(huán)，8個(gè)這樣的環(huán)組成一個(gè)β-筒狀結(jié)構(gòu)，β-筒狀結(jié)構(gòu)的一端是保守的纈氨酸疏水核，另一端是由內(nèi)部天冬酰氨組成的梯狀結(jié)構(gòu)。已知纈氨酸是疏水性氨基酸，天冬酰氨是親水性氨基酸；β-筒狀結(jié)構(gòu)的親水端與冰晶表面吻合互補(bǔ)，疏水端則有效地防止了水與冰晶的結(jié)合，阻止了冰晶繼續(xù)生長(zhǎng)。這個(gè)模型很好地解釋了植物AFPs熱滯活性低、冰重結(jié)晶抑制活性高的現(xiàn)象。

1.5抗凍蛋白的作用機(jī)理

（1）熱滯效應(yīng)。大量研究發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白降低溶液冰點(diǎn)的效率比一般溶質(zhì)要高。在較低濃度下，抗凍蛋白降低溶液冰點(diǎn)的效應(yīng)隨其濃度增加而增強(qiáng)，在較高濃度下，這種效應(yīng)逐漸趨于飽和�？箖龅鞍椎男�應(yīng)可與NaCl等溶質(zhì)的效應(yīng)相加而共同使冰點(diǎn)大幅度降低，以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)，對(duì)熔點(diǎn)影響很小，所以導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)出現(xiàn)差值。這種現(xiàn)象叫做熱滯效應(yīng)，因而抗凍蛋白也被稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白[23]。

（2）冰晶形態(tài)效應(yīng)�？箖龅鞍啄芤种票�晶生長(zhǎng)，而且這種抑制作用在不同的方向上有強(qiáng)弱之分，進(jìn)而引起冰晶形態(tài)的改變。冰通常以平行于晶格基面(a軸)的方式生長(zhǎng)，在垂直基面(c軸)很少生長(zhǎng)，因此冰晶格呈扁圓狀。低濃度的抗凍蛋白優(yōu)先抑制冰沿a軸生長(zhǎng)，因此冰晶格的六邊柱表面變得明顯。而在高濃度的抗凍蛋白下，冰晶格主要沿c軸生長(zhǎng)，形成六邊雙棱錐及針形晶體。有研究者認(rèn)為，抗凍蛋白的這種作用，可以在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)胞外冰晶的生長(zhǎng)形態(tài)，以盡量避免冰晶對(duì)細(xì)胞膜造成機(jī)械損傷[24]。（3）抑制冰晶的重結(jié)晶。重結(jié)晶是指在已經(jīng)形成的晶體顆粒之間進(jìn)行生長(zhǎng)重分配，大的愈大，小的愈小。這種情況多發(fā)生在溫度波動(dòng)之時(shí)，往往對(duì)植物體細(xì)胞造成致命傷害。而抗凍蛋白具有抑制重結(jié)晶的作用，所形成的晶體體積小而比較均勻。抑制冰的重結(jié)晶對(duì)于某些生物特別是耐凍生物具有更重要的意義，而且引人注意的就是重晶化的抑制作用比冰晶生長(zhǎng)的抑制作用更容易達(dá)到，即只需要少量抗凍蛋白(20μgmL-1)，就有較高的重結(jié)晶抑制活性

[25]

。

所以，通過克隆出能被冷誘導(dǎo)表達(dá)的IRI基因，通過轉(zhuǎn)基因手段轉(zhuǎn)移到到所需作物中，誘導(dǎo)IRI基因的表達(dá)從而提高作物的抗凍能力。

1.6AFPs的研究意義和應(yīng)用

植物抗冰凍存在著多種機(jī)制，抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)和研究揭示了植物抵御低溫的又一途徑，為我們了解植物的抗凍作用原理提供了新的思路，同時(shí)也為生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依

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據(jù)。

農(nóng)業(yè)上，從1998年，worralletal[26]從胡蘿中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)植物AFPs基因后，獲得其cDNA并將其連接道表達(dá)載體的雙CAMV35s啟動(dòng)子之后導(dǎo)人煙草，讓其組成性表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行抗凍功能驗(yàn)證。此外，還用蛋白質(zhì)免疫雜交法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了AFPs在煙草已表達(dá)。同時(shí)，將這些表達(dá)的AFPs進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)含有胡蘿卜AFPs的煙草提取物可以抑制冰晶的生長(zhǎng)。由于植物內(nèi)源AFPs基因更適合在植物體內(nèi)表達(dá)，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物在抗寒凍性改變將會(huì)更明顯。該實(shí)驗(yàn)成果為后續(xù)將抗凍性強(qiáng)的植物中的AFPs蛋白通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移到小麥、玉米、水稻等作物或是植物奠定了理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案基礎(chǔ)，使農(nóng)作物提高自身的抗凍性進(jìn)而提高糧食產(chǎn)量。

醫(yī)藥上主要將AFPs用于細(xì)胞、器官的超低溫保存。研究表明，AFPs可用于人和動(dòng)物的卵、精子、胚胎或肝臟等器官的超低溫保存，從而改善其冷凍質(zhì)量[27]。此外，由于植物AFPs的多樣性，某些植物的AFPs冰晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)比動(dòng)物AFPs大的多，所以植物AFPs在醫(yī)學(xué)上所起的作用將會(huì)更大。

由于AFPs在食品的冰凍、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和解凍等過程中均能抑制重結(jié)晶化，并能減少滴液以防止?fàn)I養(yǎng)成分的損失[28]．食品上，植物AFPs已經(jīng)應(yīng)用于冷凍食品業(yè)如：冰淇淋[29]的制造和保存，冷凍肉[30]的保存等等。

1.7植物AFPs的研究現(xiàn)狀

植物體內(nèi)AFPs的形成是比較復(fù)雜的過程，溫度的降低是形成AFPs的主要因素。溫度控制抗凍基因的表達(dá)，AFPs與植物的抗性密切聯(lián)系。相對(duì)于動(dòng)物蛋白而言，的研究植物AFPs的研究起步較晚，雖然已被研究的植物材料達(dá)40余種，但真正被分離并被轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的AFPs并不多。目前，主要對(duì)以下植物的AFPs進(jìn)行了研究：冬黑麥、千年不爛心、沙冬青、無頭甘藍(lán)、胡蘿、桃樹、冬小麥、黑麥草、唐古紅景天、珠芽蓼[31-33]。在小麥族中抗凍蛋白被稱為重結(jié)晶抑制蛋白（IceRecrystallisationInhibition，IRI）或IAPs(Ice-activeproteins)。Sandve[34]從黑麥草和大麥中分離了15個(gè)IRI蛋白基因，并與水稻、擬南芥等相應(yīng)同源基因進(jìn)行了分子進(jìn)化分析。Krishnanand[15]從黑麥草中分離了5個(gè)IAPs基因，比較結(jié)果表明其均具有IRI類似基因的典型結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)存在一定的差異。對(duì)其中3個(gè)基因進(jìn)行體外表達(dá)和功能分析發(fā)現(xiàn)，IAPs均具有抑制重結(jié)晶的活性。Tremblay[36]等從冬小麥中分離了2個(gè)IRI蛋白基因TaIRI1和TaIRI2，并對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了體外表達(dá)分析，但對(duì)于IRI蛋白基因的功能分析及遺傳轉(zhuǎn)化未做詳細(xì)研究，限制了對(duì)IRI基因功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制的全面了解。

本研究以小麥野生近緣屬種尾狀山羊草、彭梯卡侖麥草、支藥大麥草、布頓大麥草、沙生冰草為研究材料，對(duì)小麥野生近緣屬種IRI基因基因進(jìn)行分離和鑒定，克隆其編碼區(qū)，并對(duì)所克隆IRI基因進(jìn)行進(jìn)化分析，即小麥野生近緣屬種IRI基因之間彼此在堿基

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

排列、氨基酸、重復(fù)區(qū)的等的共同性與差異性。這些將為闡明小麥低溫脅迫過程中IRI基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理以及更詳盡的揭示小麥抗寒分子機(jī)制提供重要參考，同時(shí)為發(fā)掘新型抗寒基因和通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高小麥的抗寒力奠定理論基礎(chǔ)。

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2.材料、試劑

2.1材料及處理

供試材料：尾狀山羊草、彭梯卡侖麥草、支藥大麥草、布頓大麥草、沙生冰草等小麥近緣屬種編號(hào)為B1-B25(25個(gè)品種)、W1-W15（15個(gè)品種）201*系列（201*-1,201*-4,201*-7三個(gè)品種）、PI（37個(gè)品種）和W6（8個(gè)品種）系列開頭。在90個(gè)品種中，種質(zhì)資源B1-B25、W1-W15和201*系列來源于中國(guó)農(nóng)科院、PI和W6由美國(guó)種子資源中心提供。

材料處理：挑選籽粒飽滿的小麥野生近緣屬種材料種子，將其表面用75%的酒精消毒，然后將種子放在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，保持種子充分濕潤(rùn)。待幼苗生長(zhǎng)7-14d左右種子長(zhǎng)出幼苗后，選取綠色嫩葉進(jìn)行DNA提取。

2.2菌株與載體

試驗(yàn)所用大腸桿菌菌株E.coliTop10購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。質(zhì)粒載體pGM-T購(gòu)自TaKaRa公司。

2.3酶與試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒、DL201*DNAmarker、T4DNA連接酶、pGM-T載、Taq酶購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，IPTG，X-Gal，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于XYGEN公司，引物由賽百盛公司合成，測(cè)序由北京天根公司、上海生工完成；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，取自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)資處，低熔點(diǎn)瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。

液氮純度為99.999，由沈陽(yáng)特種氣體廠提供。

實(shí)驗(yàn)所用引物：

IRI-F：5-ATGGCGAAATGC(G/T)GGCTG-3IRI-F新：5-ATGGCGCC(A/G)AAATGCTGGCT-3

IRI-R1：5-ATTGTGAGCTACACTGAACTTGGACA-3IRI-R2：5-TCATTCATCTCCTACGACTTTGTT-3IRI22-R：5-CCAAGCTTTCATTCATCTCCTGTT-3IRIR1新：5-GATTGTGAGCTACACTGAACTTGG-3IRIR2新：5-TCATTCATCTCCTACGACTTTGTT-3IRIR3新：5-TTAACCTCC(T/C)GTCACGACTTTGTT-3

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

其中引物組合為：IRI-F和IRI-R1、IRI-F和IRI-R2、IRI-F和IRI22-R、IRI-F和IRIR1新、IRI-F和IRIR2新、IRI-F和IRIR3新；IRI-F新和IRIR1新、IRI-F新和IRIR2、IRI-F新和IRIR3新。

由于要克隆的IRI基因多樣性，在根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的IRI基因數(shù)據(jù)，用primer設(shè)計(jì)引物克隆小麥近緣屬種中IRI基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)即使在同源區(qū)段也存在一個(gè)或多個(gè)堿基的不同，所以設(shè)計(jì)了兼并引物的同時(shí)也設(shè)計(jì)了多對(duì)引物。本課題研究的是克隆多個(gè)與小麥親緣關(guān)系較近的植物屬種的IRI基因，數(shù)據(jù)量以及信息較多，所以利用多對(duì)引物對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行廣泛的IRI基因篩選。

2.4實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器及生物軟件

主要儀器：BIO-RADPTC-200型PCR儀；BIO-RAD凝膠成像儀；DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；超純水儀(PALLPL5243)；HERMLEZ233MK-2臺(tái)式微量冷凍離心機(jī)；HITACHISCR20BA高速冷凍離心機(jī)；HH-6恒溫水浴鍋；MP200A分析天平；Eppendorf移液器2.5ul、10ul、100ul、1000ul；超凈工作臺(tái)。

相關(guān)生物學(xué)軟件及網(wǎng)站：引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0，序列分析軟件DNAMAN，MEGA3.0，NCBIBlast：。

2.5相關(guān)試劑的配制

液體LB培養(yǎng)基（1L）：

細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10.0g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5.0gNaCl10.0g

固體LB培養(yǎng)基（1L）：

細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10.0g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5.0gNaCl10.0g瓊脂15.0g

在950mL去離子水中加入以上各溶質(zhì)，充分?jǐn)嚢枞芙�，滴�?molL-1NaOH（約0.2mL）調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L（固體培養(yǎng)基每L加15g瓊脂粉），121℃高壓蒸汽滅菌20min。

100mgmL-1氨芐青霉素（Amp）貯液：稱取100mgAmp溶于1mLddH2O中，

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用0.22m濾器過濾除菌，-20℃保存。

0.1molmL-1IPTG（異丙基硫代β-D-半乳糖苷）：稱取2gIPTG溶于8mLddH2O中，充分混合溶解后定容至10mL，用0.22m濾膜過濾除菌，每份1mL，-20℃保存。

20mgmL-1X-Gal（5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷）：稱取1gX-Gal置于50mL離心管中，加入40mLDMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后定容至50mL，每份1mL，-20℃避光保存。

10gmL-1EB溶液（溴乙錠）：1mg溴乙錠加入100mL去離子水中，充分溶解后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存。工作時(shí)稀釋到0.5gmL-1。

10×TBEBuffer（pH8.3）：Tris108gNa2EDTA2H2O7.44g硼酸55g定容至1000mL，室溫保存。

上樣緩沖液（6×）：稱取溴酚藍(lán)250mg，加重蒸水10mL，室溫下過夜，待溶解后再稱取蔗糖40g，加重蒸水溶解后移入溴酚藍(lán)溶液中，混勻后加重蒸水定容至100ml。

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3.實(shí)驗(yàn)方法與步驟

3.1植物基因組DNA的提�。ㄖ参锘�因組DNA提取試劑盒）

1）取植物新鮮組織100mg或干重20mg，加液氮充分研磨。用小勺取適當(dāng)研磨碎屑于1.5ml或2.0ml離心管中，離心管中已加入400ml緩沖液LP1和6LRNaseA（10mg/L），漩渦震蕩1min靜置10min（室溫）。

2）加入130ml緩沖液LP2，充分混勻，漩渦震蕩1min。3）1201*r/min離心5min，將上清液移至新離心管。

4）加入1.5倍體積緩沖液LP3立即充分混勻15s，可能會(huì)有絮狀沉淀。

5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），1201*r/min離心30s，倒廢液，吸附柱CB3放入收集管中。注：因步驟4中總體積=750+500=1250L，而吸附柱最大容積為700L。故步驟5分為兩小步：（1）.先吸取700L液加入到吸附柱CB3，1201*r/min離心30s，倒廢液。（2）.再吸剩余550L液加入到吸附柱CB3重復(fù)一次。

6）向吸附柱CB3中加700ml漂洗液PW（使用前檢查是否已加入無水乙醇），1201*r/min離心30s。倒廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。注：若吸附柱膜呈綠色，向吸附柱CB3中加500L無水乙醇，1201*r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。7）向吸附柱CB3中加入500L漂洗液PW，1201*r/min離心30s，倒掉廢液。

8）將吸附柱CB3放回收集管中，1201*r/min離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3放置室溫?cái)?shù)分鐘（5-6min）以徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液。注：這一步目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液，漂洗液中乙醇的殘余會(huì)影響后續(xù)酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

9）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加50-200L洗脫緩沖液TE，室溫靜置2-5min，1201*r/min離心2min，將溶液收集到離心管中。注：為增加基因組DNA得率，可將離心溶液再加入吸附柱CB3中室溫靜置2min。

3.2IRI基因的PCR擴(kuò)增

PCR體系：下述溶液、試劑按順序添加

ddH201*.6l

10×TaqPCR緩沖液2.5ldNTPs0.4l引物F1.0l引物R1.0l

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模板DNA2l

Taq酶（Tiangen）0.5l注：引物F指代IRI-F、IRI-F新

引物R指代IRI-R1、IRI-R2、IRI22-R、IRIR1新、IRIR2新、IRIR3新

總體積：25l。

PCR程序：

94°C5min

94°C30s50-60°C45s72°C1min72°C7min16°C10min

將PCR程序擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物與溴酚藍(lán)或6*loadingbuffer或10*loadingbuffer上樣緩沖液混勻，點(diǎn)入電泳槽的瓊脂糖凝膠孔槽中。

注：退火溫度為50-60°C表示由于引物組合不同，PCR反應(yīng)最適合的退貨溫度不同。實(shí)驗(yàn)中所用的引物對(duì)應(yīng)PCR的最適合溫度采用的是梯度PCR篩選的，即退貨溫度50-60°C進(jìn)行篩選的。

35個(gè)循環(huán)

3.3目的片段與載體連接

連接體系（連接試劑盒由天根生化科技公司提供）

目的PCR片段7lPGM-T載體1l連接酶緩沖液1lT4DNA連接酶1l反應(yīng)體系總體積：10l

上述溶液按順序分別加入200l的PCR管中后，混合液輕輕震蕩后順勢(shì)離心，置于16℃鏈接反應(yīng)10-12h。連接后的產(chǎn)物直接用來轉(zhuǎn)化或者置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫ㄟB接產(chǎn)物不穩(wěn)定，連接過后產(chǎn)物所處的溫度越高連接的效果降低越快，若保存2-3天需置于-20℃冰箱）。

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3.4轉(zhuǎn)化

1）將恒溫水浴鍋溫度調(diào)至42℃。

2）取5l重組DNA混合液加入100l感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕震蕩后置于冰上30min。3）輕輕搖勻后放置冰上，42℃水浴鍋中熱擊90S，然后迅速放回冰中，靜置3-5min。4）在超凈工作臺(tái)上向管中加入500l預(yù)熱至37℃的LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），輕輕混勻然后固定到搖床的彈簧架上，37℃低速震蕩1h。

5）將含50mlLB固體培養(yǎng)基放入微波爐熔化后放置于超凈工作臺(tái)，待LB固體培養(yǎng)基冷卻至60℃左右（不燙手時(shí)）時(shí)加入25l100mg/ml的Amp，混勻后分裝于2個(gè)平板培養(yǎng)皿中。待LB固體培養(yǎng)基室溫冷卻凝固后再用。

6）取出步驟4）中菌液，5000-7000轉(zhuǎn)離心5min，用移液器吸掉200l上清液，把離心管中剩余的上清液和離心管底部菌液混勻。

7）在超凈工作臺(tái)上取上述轉(zhuǎn)化的菌液100-300l，滴到LB平板培養(yǎng)皿（含50g/ml的Amp）中，再在平板上滴加40l20mg/ml的x-gal，10l0.1mol/l的IPTG，用燒過的玻璃棒冷卻后涂布均勻。

8）在涂好的培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，先正放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30min，待培養(yǎng)基表面的液體都滲入培養(yǎng)基后，倒置培養(yǎng)皿，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜（12-16h），出現(xiàn)菌落。

3.5陽(yáng)性克�。核{(lán)白斑篩選

經(jīng)過過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)板上生長(zhǎng)出藍(lán)白斑，藍(lán)斑為T載體自身連接形成的空質(zhì)粒，白斑為目的基因與T載體連接形成的環(huán)形質(zhì)粒。篩選出白斑，用消過毒的牙簽或接種針挑取單個(gè)菌落，于平板LB固體培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)（12-16h）。

3.6菌落PCR

ddH201*.6l

10×TaqPCR緩沖液2.5ldNTPs0.4l引物F1.0l引物R1.0l

模板DNA2l

Taq酶（Tiangen）0.5l程序同之前的PCR一樣。

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3.7搖菌測(cè)序

1)取1.5ml離心管，加入1mlLB液體培養(yǎng)基，再加入1l100mg/ml的Amp并編號(hào)。2）選取之前菌落PCR出現(xiàn)目的片段的單菌落，用滅過菌的牙簽或槍頭挑菌到LB液體培養(yǎng)基的離心管中，混勻。封蓋，并用封口膜封住離心管蓋邊緣防止雜菌污染。3）置于37℃水浴或空氣浴搖床，180r/min過夜培養(yǎng)12-16小時(shí)。4）送至測(cè)序公司測(cè)序。

4．實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

201*bp1000bp750bp500bp250bp100bpB15B19B25圖4.1

B2marker

根據(jù)primer引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的引物，對(duì)小麥近緣屬種進(jìn)行IRI克隆的片段的大小應(yīng)該在700-1000bp左右。圖中的B2為單一的亮帶，而B25、B19、B15出現(xiàn)了多條帶，主要由于IRI基因是一個(gè)多基因家族，所以在用PCR過程中，同一對(duì)引物的PCR可能同時(shí)兩條或多個(gè)片段在700-1000bp的條帶，由于對(duì)這些條帶的序列未知，所以這些片段都進(jìn)行回收做后續(xù)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，以確定是否為IRI基因。圖中還出出現(xiàn)了在700-1000bp外出現(xiàn)了其它片段和同一品種間條帶亮度不一（如B25三個(gè)孔槽中只有退火溫度不同，導(dǎo)致了條帶亮度不同），這樣的原因是由于實(shí)驗(yàn)所用的引物為通用引物，而

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

且PCR程序在篩選最適的退火溫度中用了梯度溫度。圖中700-1000bp有條帶而且清晰，確保了可以做切膠回收，做后續(xù)步驟。

4.2測(cè)序結(jié)果及分析

表4.1

通過用9對(duì)引物（IRI-F和IRI-R1、IRI-F和IRI-R2、IRI-F和IRI22-R、IRI-F和IRIR1新、IRI-F和IRIR2新、IRI-F和IRIR3新；IRI-F新和IRIR1新、IRI-F新和IRIR2、IRI-F新和IRIR3新），對(duì)小麥野生近緣屬種編號(hào)為B1-B25、W1-W15、W1-W15（15個(gè)品種）、Pi和W6系列進(jìn)行IRI基因克隆。

在供試材料90個(gè)品種中，許多小麥野生近緣屬種的植物種子萌發(fā)過程實(shí)驗(yàn)中從未發(fā)芽，沒有綠葉。其次在種子萌發(fā)成幼苗的品種提取DNA后進(jìn)行IRI基因的PCR擴(kuò)增,許多也出現(xiàn)沒有擴(kuò)增條帶，或者是擴(kuò)增出的條帶不在預(yù)計(jì)700-1000bp范圍內(nèi)。最終能通過PCR得到700-1000bp片段的品種列舉在表4.1中。

表4.1列舉了所用引物組合的PCR反應(yīng)能擴(kuò)增出700-1000bp左右的片段。在擴(kuò)增的片段中，有的能擴(kuò)增出一條在700-1000bp條帶，而有的能在700-1000bp間擴(kuò)增出多條片段，如W22-W25能擴(kuò)增4條片段。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，即使PCR過程中我們能用引物擴(kuò)增出預(yù)計(jì)IRI基因額大小片段，但是許多的測(cè)序結(jié)果不是，只有少數(shù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在后續(xù)產(chǎn)物中測(cè)序后進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)與IRI基因相似性高（B2、B13、B15、B19、B25、W5、

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201*-1、W6-19191）。

分析上述結(jié)果，有以下幾點(diǎn)原因：(1)重結(jié)晶抑制蛋白IRI基因是一個(gè)多基因家族，即使是同一個(gè)品種也會(huì)有多個(gè)IRI基因；（2）由于設(shè)計(jì)的引物是兼并引物，在PCR過程中與目的DNA的結(jié)合性不緊密而結(jié)合到別的片段上，擴(kuò)增出片段，而這些擴(kuò)增的片段可能在我們正需要的700-1000bp之間，也可能不在；（3）多對(duì)引物組合，不同的引物組合得到進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同的結(jié)果。

4.3測(cè)序結(jié)果的DNA多序列比多和氨基酸序列比對(duì)分析

經(jīng)過NCBIBlast：網(wǎng)站對(duì)測(cè)序結(jié)果的基因比對(duì)，去除掉與IRI相似性極低的序列，最終篩選出編號(hào)為B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21共8個(gè)序列可以使用。這些獲得的IRI基因編號(hào)對(duì)應(yīng)的植物品種分別為：B2-沙生冰草、B15-簇生麥草、B24-布頓大麥草、B25-支藥大麥草、W15-單芒山羊草、W17-高大山羊草、W21-擬斯卑爾脫山羊草。

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

B2a.seqB2b.seqB15c.seqB24.seqB25.seqW15.seqW17.seqW21.seqATGGCGCCGAAATGCTGGCTGCTGCTCCACTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCGGCGGCGAGCGCTACGTCGTGCCATGCTGACGACCTCCACGCGCTGCAGGGCTTCGCCGGGAATCTCAGT...........ATGCGGGCTGCTACTCCTGTTCT.GGCGTTCCTCTTGCCTGTGGCAAGCGCGACGTCATGTCACGCTGATGACCTCCATGAGCTGCGGGGCTTCGCTGGGAAGCTCACA...ATGGCGAAATGCGGGCTGCTGCTCCACTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCGGCGGCGAGCGCTACGTCGTGCCATGCTGACGACCTCCTCGCGCTGCAGGGCTTCGCCGGGAATCTTAGTATGGCGCCAAAATGCTGGCTGATGCTCCTCTTCTTGGTGTTTCTCCTGCCGGCGACGAGCGCGAGGTCGTGCCACGCCGACGACCTCCGTGCACTGCGGGACTTCGCCCGGAACCTCACT...ATGGCGAAATGCTGGCTGCTGCTCCTGTTCTTGGCGTTCCTCTTGCCAGCGGCACGTGCAACGTCATGCCACCCCGATGACCTCCGCGCGCTACGGGGCTCTGCCGGGAACCTTAGT...ATGGCGAAATGCTGGCTGGTGCTCCTCTGCTTGGTGTTCCTCCTGCTGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCTGCACTCTGCGGGACTTTGCCCGGAACCTCACC...ATGGCGAAATGCGGGCTGGTGCTCCTCTGCTTGGTGTTCCTCCTGCTGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCTGCACTCTGCGGGACTTTGCCCGGAACCTCACC...............GGGCTGATGCTCCTCTTCTTGGTGTTTCTCCTGCCGGCGACGAGCGCGACGTCGTGCCACGCCGACGACCTCCACGCACTGCGGGAATTCGCCCGGAACCTCACC11111111B2a.seqB2b.seqB15c.seqB24.seqB25.seqGGTGGCGGCGTGCTCCTACGCGCTGTGTGGTCCGGCGCCTCGTGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGAGCTGCGACAGCACAAGTGGACGCGTCACGGCGCTTTGGCTCACCGGGCGCAGCCTTGGCGGTGGCGTGCTTCTCCGCGCCGCGTGGTCTGGCACTTCATGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGGGTTGTGACGGCGCAAGTGGACGGGTCACCGTGTTGCGGCTCCCAGGGTGCGGCCTTGGTGGCGGCGTGCTCCTACGCGATGTGTGGTCCGGCGCCTCGTGCTGCGGCTGGGAAGGTGTGAGCTGCGACGGCACAAGTGGACGCGTCACGGTGCTTTGGCTCCCCGGGCGCAGCCTTGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGGACATCGTGTTGCAGATGGGAAGGTGTGGGCTGCAACGGCGCAAGTGGACGCGTCACAACGCTGCGGCTTCCCGGCCGCGGCCTTGGTAGGGCTGTCCTCCTCCGTGCTGCGTGGTCCGATGCCTCGTGCTGAGGCTGGGAAGGTGTGGGCTGCCATCGTGCTAGTGGCCGCGTCACGTCCCTGCGGCTCCCTGGACACGGCCTT22222W15.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGAACCACGTGTTGTGGCTGGGAAGGTGTGAACTGCGACGGCGTAAGTGGACGCGTCACGGCGCTGCGGCTCCCCGGGCGCGGCCTTW17.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGTGCAGCGTGGTCCGGAACCACGTGTTGTGGCTGGGAAGGTGTGAACTGCGACGGCGTAAGTGGACGCGTCACGGCGCTGCGGCTCCCCGGGCGCGGCCTTW21.seqGGCGGTGGCGTCATCCTCCGCGCAGCGTGGTCCGGCACCTGGTGTTGCAGATGGGAAGGTGTGGGCTGCGACGGCGGAAGTGGACGCGTCACAACGCTGCGGCTTCCCGGACGCGGCCTTB2a.seqGCGGGGCCCATCCCAGGAGCTTCCTTGGTGGGCCTCACGCAACTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAAACTAATCGGCAACATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCB2b.seqACTGGACCCATCCCAGGAGCATCCTTTGCGGGCCTGGTGCAGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAGCAACAGATTGGTCAGCACCATCCCTTTGTGGATCGGTGAGCTTCAACACCTTTGCB15c.seqGCGGGGCCCATCCCAGGAGCCTCCTTGGTGGGCCTCACGCAACTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAAACTAATCGGCAACATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCB24.seqGCAGGACCCATCGCAGGAGCATCCTTGGCGGGCTTAGCGTGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGGCTGATCGGCACAATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTB25.seqGCGGGGGCCATCCCAAGAGCATCCTTGGCAGGCCTCGCACGGTTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGGTTGGCACCATCCCATCGTGGATTGGCCAGCTTGATCACCTTTGCW15.seqGCAGGACCCATTGCAGGAGCATCCTTGGCAGGCCTGGCATGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACCATTCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGACCACCTTCGTW17.seqGCAGGACCCATTGCAGGAGCATCCTTGGCAGGCCTGGCATGGCTGGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACCATTCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGACCACCTTCGTW21.seqGCAGGACCCATCGCTGGAGCATCCTTGGCGGGCTTGGCGCGGCTAGAGGAGCTCAACCTTGCCAACAACAGACTGATCGGCACATTCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTB2a.seqTACTTGGATCTCTCCGATAATTCATTGGAAGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACGGCTTAAGGGTCTCGTTGCTGCTGGACGTTCAGTGGGTATGACATTCACTAACATGCCATTGTATB2b.seqTACTTGGATCTCTCTGATAATCCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCAGCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCGTTCACTAATATGCCATCGTATB15c.seqTACTTGGATCTCTCCGATAATTCATTGGAAGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACGGCTTAAGGGTCTCATTGCTGCTGGTCGTTCAGTGGGTATGACATTCACTAACATGCCATTGTATB24.seqTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTGATACGGTTCAAGGACATCACCAGCGCTGGTCGCTCATTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATB25.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGTTACAGCTCAAGGGCCTAGTCATCGCTGGTCCTTCATCGGGTATGACTTTTACTAGCATGCCTTTGTATW15.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCGCCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATW17.seqTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGATTGGCGAGGTACCCAAGAGTTTGATACGGTTCAAGGGCATCGCCATCGCTGGTCGTTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTGTATW21.seqTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTGATACGGTTCAAGGACATCACCATCGCTGGTCGCTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTATATB2a.seqGAGAAGCATAACCGAAGAACACTCCAAC...AACAACAACCAAATATCATATCCGGGACAAACAACAAAGTCAGATCTGGTAGAACCAATGTTGTATCTGGAAATGACAACACGGTCAAAB2b.seqGTGAAGCGTAACAGAAGAACACTCCAGG...AACAACAACCAAACACAATATCTGGGACCAACAATACTGTCAGATCTGGGAGAAACAATGTTGTTGCCGGGAACGACAACACTGTCATAB15c.seqGTGAAGCGTAACCGAAGAACACTCCAAC...AACAACAACCAAGTATCATATCCGGGACAAACAACAAAGTCAGATCTGGTAGAACCAATGTTGTATCTGGAAATGACAACACGGTCATAB24.seqGTGAAGCGTAACAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACGATATCTGGGACCAACAATAGCGTCAGATCTGGGAGAACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAB25.seqGGGAAGCGTAACAAAAGAACGCTTGACG......AACAACCAAATACAATATCTGGGAGTAACAACACCGTCAAATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAATACTGTCATAW15.seqGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCCACCAAATACGATATCAGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTAGGAATGACAACACTGTCATAW17.seqGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACGATATCAGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAW21.seqGTGAAGAGTAACAGAAGAACACTCCAACAACAACCTCAACCAAATACAATATCTGGGACCAACAATACCGTCAGATCTGGGAGCACCAATGTTGTTTCTGGGAATGACAACACTGTCATAB2a.seqTCTGGAAACAACAACACTGTGGCTGGGAGCAACAATACCATCACAACTGGGAGCGACAATACCGTAGTAGGTAGCAACCATGTCGTATCTGGGACCAAACATATCGTAACTGACAACAACB2b.seqTCCGGCGACAACAACAATGTGTCTGGGAGCAACAACACTATCGTAACGGGGAGCGACAATACCGTAGTTGGTAGCAACCATGTTGTATCTGGGAACAAACATGTCGTAACTGACAACAACB15c.seqTCTGGAAACAACAACACTGTGGCTGGGAGCAACAATACCATCACAACTGGGAGCGACAATACCGTAGTAGGTAGCAACCATGTCGTATCTAGGACCAAACATATCGTAACTGACAACAACB24.seqTCCGGGGACAACAACAATGTGTCCGGGAGTAACAACACTATCGTTACCGGTAGCGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAACATGTTGTAACTGACAACAACB25.seqTCCGGGAACTACAACAATGTGGCTGGGAGCAACAACACTATCGTAACCGGGAGCGATAATACTGTAACTGGTAGCAACCATGTCGTATCTGGGGACAAACATATCGTAACTGACAACAACW15.seqTCTGGTAACAACAACAGTGTGTCAGGGAGTAACAACACTATCATAACCGTTAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCA.CCATGTCGTATCTGGGAACAAGCATGTCATAACTGACAACAACW17.seqTCTGGGAACAACAACAGTGTGTCAGGGAGTAACAACACTATCATAACCGGGAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAGCATGTCATAACTGACAACAACW21.seqTCCGGGAACAACAACAATGTGTCCGGGAGTAACAACACTATCGTAACCGGTAGTGACAATACCGTAGTTGGAAGCAACCATGTCGTATCTGGGAACAAACATGTCGTAACTGACAACAACB2a.seqAATGTTGTTTCCGGGATTGACAATAATGTATCCGGCAGCTTCCACACCGTATCCGGGAGTCACAATACCATATCCGGGAGCAACAATACCGTATCAGGGAGCAACCATATTGTGTCTGGGB2b.seqAATGTCGTATCCGGAGACGACAATACTGTATCCGGGAGCTTCCATACCGTATCTGGGAGCCACAACACCGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGGACCAACCATGTCGTCTCTGGGB15c.seqAATGTTGTTTTCGGGATTGACAATAATGTATCCGGCAGCTTCCACACCGTATCCGGGAGTCACAATACCATATCCGGGAGCAACAATACCGTATCAGGGAGCAACCATATTGTGTCTGGGB24.seqAATGCCGTATCCGGAAATGACAATAATGTATCCGGGAGTTTCCATACCGTATCCGGGAGCCGCAT.ACTGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCACGTCGTGTCTGG.B25.seqAATGTCGTATCCGGAAATGACAATAATGTATCCGGAAGCTTCCATACCGTATCCGAGAGCAAGAATATTGTATCTGGGAGCAACAACACTGTATCTGGGAGCAACCATGTTGTATCCGGGW15.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCTGG.AGCTTCCATACGGTATCCGGGAGCCTCAATACA.TATCTGGGAGCAACAT.ACCGTATCTGGCAGCAT.CATGTCGTGTCTGGGW17.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCCGGGAGCTTCCATACGGTATCCGGGAGCCGCAATACAGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCATGTCGTGTCTGGGW21.seqAATGCCGTATCCGGAAACGACAATAATGTATCCGGGAGCTTCCATACCGTATCCGGGAGCCGCAATACTGTATCTGGGAGCAACAATACCGTATCTGGAAGCAACCACGTCGTGTCTGGGB2a.seqAGCAACAAAGTCGTGACGGGAGGTTAA...B2b.seqAGCAACAAAGTCG...TAGGAGATGAATGAB15c.seqAAGCAACAAGTCGTGACGGGAAGTTAA...B24.seqAGCAACAAAGTCGTAACAG.AGATGAATGAB25.seqAGCAACAAAGTCG...TAGGACATGCATGAW15.seqAGCAACAAAGTCG.AACAG.AAATGAATGAW17.seqAGCAACAAAGTCGTAACAGGAGATGAATGAW21.seqAGCAACAAAGTCGTAACAGGAGATGAATGA圖4.2DNA序列比對(duì)圖（B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21）

在獲得并分析的IRI基因中，DNA序列最短的為849bp，最長(zhǎng)為864bp，片段在

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222333333334444444455565555777777778888888888888888

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700-1000bp區(qū)間內(nèi)，其中B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25編碼的氨基酸總數(shù)分別為287、283、286、288、284、285、288、284。圖4.2中為所獲得并能分析的IRI基因，圖中藍(lán)黑色背景的堿基為8基因完全共有的區(qū)段片段，我們可以清晰到看到這些IRI的DNA片段共有區(qū)段多，相似性高；白色背景中的黑點(diǎn)表示在DNA序列比對(duì)中，此處不具有共有的堿基，其它背景顏色表示部分DNA共有堿基。

B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQMAPKCWLLLHFLAFLLPAASATSCHADDLHALQGFAGNLSGGGVLLRAVWSGASCCGWEG....MRAATPVLAFLLPVASATSCHADDLHELRGFAGKLTGGGVLLRAAWSGTSCCGWEG.MAKCGLLLHFLAFLLPAASATSCHADDLLALQGFAGNLSGGGVLLRDVWSGASCCGWEGMAPKCWLMLLFLVFLLPATSARSCHADDLRALRDFARNLTGGGVILRAAWSGTSCCRWEG.MAKCWLLLLFLAFLLPAARATSCHPDDLRALRGSAGNLSGRAVLLRAAWS.DASCGWEG.MAKCWLVLLCLVFLLLATSATSCHADDLCTLRDFARNLTGGGVILRAAWSGTTCCGWEG.MAKCGLVLLCLVFLLLATSATSCHADDLCTLRDFARNLTGGGVILRAAWSGTTCCGWEG.....GLMLLFLVFLLPATSATSCHADDLHALREFARNLTGGGVILRAAWSGTWCCRWEG6056596058595955B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQVSCDSTSGRVTALWLTGRSLAGPIPGASLVGLTQLEELNLANNKLIGNIPSWIGELDHLCVGCDGASGRVTVLRLPGCGLTGPIPGASFAGLVQLEELNLASNRLVSTIPLWIGELQHLCVSCDGTSGRVTVLWLPGRSLAGPIPGASLVGLTQLEELNLANNKLIGNIPSWIGELDHLCVGCNGASGRVTTLRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELEHLRVGCHRASGRVTSLRLPGHGLAGAIPRASLAGLARLEELNLANNRLVGTIPSWIGQLDHLCVNCDGVSGRVTALRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELDHLRVNCDGVSGRVTALRLPGRGLAGPIAGASLAGLAWLEELNLANNRLIGTIPSWIGELDHLRVGCDGGSGRVTTLRLPGRGLAGPIAGASLAGLARLEELNLANNRLIGTFPSWIGELEHLR1201*61191201*8119119115B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQYLDLSDNSLEGEVPKSLLRLKGLVAAGRSVGMTFTNMPLYEKHNRRTLQQQQ.PNIISGTYLDLSDNPLIGEVPKSLIRFKGISIAGRSLGKAFTNMPSYVKRNRRTLQEQQ.PNTISGTYLDLSDNSLEGEVPKSLLRLKGLIAAGRSVGMTFTNMPLYVKRNRRTLQQQQ.PSIISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKDITSAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPQPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLLQLKGLVIAGPSSGMTFTSMPLYGKRNKRTLDEQ..PNTISGSYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKGIAIAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPPPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKGIAIAGRSLGKAFTNMPLYVKRNRRTLQQQPQPNTISGTYLDLSDNSLIGEVPKSLIRFKDITIAGRSLGKAFTNMPLYVKSNRRTLQQQPQPNTISGT179175178180176179179175B2ATRANSLATION.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.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.SEQB2BTRANSLATION.SEQB15CTRANSLATION.SEQB24TRANSLATION.SEQB25TRANSLATION.SEQW15TRANSLATION.SEQW17TRANSLATION.SEQW21TRANSLATION.SEQNVVSGIDNNVSGSFHTVSGSHNTISGSNNTVSGSNHIVSGSNKVVTGG.NVVSGDDNTVSGSFHTVSGSHNTVSGSNNTVSGTNHVVSGSNKVVGDE.NVVFGIDNNVSGSFHTVSGSHNTISGSNNTVSGSNHIVSGKQQVVTGS.NAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRILYLGATIPYLEATTSCLEQQSRNRDE.NVVSGNDNNVSGSFHTVSESKNIVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVGHA.PYPETTIMYLELPYGIREPQYIS..GSNIPYLAASCRVWEQQSRTEMN.NAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRNTVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVTGDENAVSGNDNNVSGSFHTVSGSRNTVSGSNNTVSGSNHVVSGSNKVVTGDE287283286288284285288284

圖4.3氨基酸序列比對(duì)圖（B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W21），圖中下劃線表示信號(hào)肽，向上的箭頭表示半胱氨酸殘基，水平向右的箭頭表示LRR（亮氨酸酸富集區(qū)），水平雙

向箭頭代表NxVxxG/NxVxxG區(qū)。

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

由于DNA的序列比對(duì)只能說明基因在堿基上相似性等相關(guān)問題，而基因的功能是通過蛋白表達(dá)表現(xiàn)出來的，而且在DNA序列中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)堿基的插入或者缺失導(dǎo)致移碼突變，或者由于堿基突變但不一定引起氨基酸的改變等現(xiàn)象，所以我們我們將DNA翻譯成氨基酸，從氨基酸層面上對(duì)所獲得8個(gè)基因進(jìn)行分析，同時(shí)結(jié)合DNA序列和氨基酸序列進(jìn)行分析。

圖4.3氨基酸比對(duì)圖中，橫線下劃線處為8個(gè)IRI基因氨基酸的信號(hào)肽區(qū)域，從圖中可以看出8個(gè)IRI基因氨基酸的的信號(hào)肽并非完全相同，只是部分的氨基酸相同。真核細(xì)胞N末端的信號(hào)肽位，一般由15～30個(gè)氨基酸組成。包括三個(gè)區(qū)：一個(gè)帶正電信號(hào)肽的N末端，稱為堿性氨基末端：一個(gè)中間疏水序列．以中性氨基酸為主，能夠形成一段d螺旋結(jié)構(gòu)，它是信號(hào)肽的主要功能區(qū)；一個(gè)較長(zhǎng)的帶負(fù)電荷的C末端，含小分子氨基酸，是信號(hào)序列切割位點(diǎn)，也稱加工區(qū)。當(dāng)信號(hào)肽序列合成后，被信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)所識(shí)別，蛋白質(zhì)合成暫�；驕p緩，信號(hào)識(shí)別顆粒將核糖體攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，蛋白質(zhì)合成重新開始。在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔．而信號(hào)肽序列則在信號(hào)肽酶的作用下被切除，這些信號(hào)肽的不同將引起其表達(dá)過程中的差異。

半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)折疊過程中起著重要作用。偶數(shù)的半胱氨酸殘基可以兩兩形成二硫鍵，二硫鍵能使蛋白折疊更加緊密，而奇數(shù)的半胱氨酸殘基則會(huì)多出一個(gè)半胱氨酸殘基，對(duì)蛋白折疊牢固產(chǎn)生影響[37]。除了編號(hào)為B25基因的氨基酸有三個(gè)半胱氨酸殘基外，其余的7個(gè)IRI基因均有四個(gè)半胱氨酸殘基（圖4.3）,該半胱氨酸的改變可能B25植物的抗寒能力，但是需要要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

和其它已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的重結(jié)晶抑制蛋白一樣，我們?cè)谖覀兯�獲得的8個(gè)基因中也含有亮氨酸富集區(qū)（LLR）。圖4.3中水平右向箭頭起向右區(qū)域可以清晰看到多個(gè)L的重復(fù)。

圖4.1中可以看到在DNA序列比對(duì)上W15和B24的C末端和其它6個(gè)基因的相似性和重復(fù)性非常高，而在圖4.2中在紅色矩形框內(nèi)，發(fā)現(xiàn)W15和B24編碼的氨基酸序列和其它6個(gè)基因基本上沒有相似性，這樣的原因可能是由于堿基插入或缺失造成，導(dǎo)致移碼突變，后續(xù)氨基酸的編碼全部錯(cuò)位，這種結(jié)構(gòu)變化可能導(dǎo)致整個(gè)IRI蛋白的失活，或者功能降低。

4.4IRI的進(jìn)化分析

本研究將所獲得的IRI基因和從NCBI搜索的多個(gè)小麥野生近緣植物IRI基因匯總在一起，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。圖4.4和圖4.5是基因進(jìn)化分析的兩種不同表現(xiàn)形式，圖4.4無根樹形式可以直觀的看到基因的分類和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，而圖4.5有根樹親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近更形象的展示出來。其中如圖4.4中可以大致分為六個(gè)部分:EU887261.1,AK360260.1,B25,AY968588.1;AK360446.1;FJ663038.1和EU680848.1;B2a和B15c;B2b;

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AK360446.1;W17。

由分子進(jìn)化樹可以看出，AK360260.1（大麥草）、EU887261.1（大麥草）和B25（支藥大麥草）親緣關(guān)系最近；B2A（沙生冰草）和B15（簇生麥草）親緣關(guān)系最近；B2B（沙生冰草）與其它物種的情緣關(guān)系較遠(yuǎn)；B24（布頓大麥草）和W21（擬斯卑爾脫山羊草），W15（單芒山羊草）與W17（高大山羊草）在IRI基因分類上較近。

對(duì)于從同一材料中克隆出的IRI基因（B2a和B2b來自同一植物）親緣關(guān)系應(yīng)該是最近的，但B2a和B15c親緣關(guān)系比B2a和B2b更近，說明IRI基因家族存在較為豐富的變異，推測(cè)可能是在植物長(zhǎng)期進(jìn)化過程中不斷適應(yīng)低溫變化而調(diào)整自身基因結(jié)構(gòu)從而適應(yīng)低溫環(huán)境的原因。

AK360260.1Translation.seqEU887261.1Translation.seqB25Translation.seqAY968588.1Translation.seqAK360446.1Translation.seqEU680848.1Translation.seqFJ663038.1Translation.seqB2aTranslation.seqB15cTranslation.seqB2bTranslation.seqB24Translation.seqW21Translation.seqW15Translation.seqW17Translation.seq0.05

圖4.4IRI基因進(jìn)化分析-有根樹

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

AK360446.1Translation.seqFJ663038.1Translation.seqEU680848.1Translation.seqAY968588.1Translation.seqB2aTranslation.seqB15cTranslation.seqB25Translation.seqEU887261.1Translation.seqAK360260.1Translation.seqB2bTranslation.seqW17Translation.seqW21Translation.seqB24Translation.seqW15Translation.seq0.05圖4.5IRI基因進(jìn)化分析-無根樹

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5．討論

本文利用同源克隆的思維方法，根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的IRI序列的信息，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物對(duì)小麥野生近緣屬種IRI基因進(jìn)行分離，以分析不同小麥族材料間IRI基因的結(jié)構(gòu)變化和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。從最初的9對(duì)引物對(duì)90個(gè)小麥野生近緣材料的IRI基因進(jìn)行擴(kuò)增，最終我們得到了編號(hào)為B2A、B2B、B15C、B24、B25、W15、W17、W25的8個(gè)IRI基因，而8個(gè)基因分屬7個(gè)材料（其中B2A和B2B來源于同意材料）。

在進(jìn)行PCR的過程中，對(duì)90個(gè)植物品種中我們用了多對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)還分別運(yùn)用了梯度PCR進(jìn)行篩選最適的引物退火溫度、小套大的嵌套PCR和降落PCR（TouchdownPCR）去除非特異擴(kuò)增。TouchdownPCR是指每隔一個(gè)循環(huán)降低1°C反應(yīng)退火溫度，直至達(dá)到—Touchdown‖退火溫度，然后以此退火溫度進(jìn)行10個(gè)左右的循環(huán)。該方法最初出現(xiàn)是為了避開確定最佳退火溫度而進(jìn)行的復(fù)雜的反應(yīng)優(yōu)化過程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量的兩倍差異（每攝氏度造成4倍差異）。因此相對(duì)于非正確產(chǎn)物，正確的產(chǎn)物可以得到富集該方法。即便使用了多種PCR方法，在PCR產(chǎn)物凝膠電泳中我們依然發(fā)現(xiàn)了有多個(gè)條帶在700-1000bp。

實(shí)驗(yàn)中中得到的B2A和B2B說明了我們進(jìn)行克隆的IRI基因并不只以單基因形式存在，而是多基因家族。B2A、B2B編碼的氨基酸總數(shù)分別為287、283，在長(zhǎng)度上相差12bp，在這瓊脂糖凝膠電泳中基本上看不出差異，這表明在實(shí)驗(yàn)過程中，即使我們獲得了陽(yáng)性克隆鑒定的目的大小片段，但在測(cè)序中，選取多個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定是必要的。

本研究所得所有IRI基因和已知基因具有很多保守區(qū)域，如信號(hào)肽、半胱氨酸、LRR區(qū)，而就多數(shù)重結(jié)晶抑制蛋白IRI而言，它有其自身特有的的重復(fù)IRI區(qū)(NxVxxG)和(NxVxG)，x表示在N和V之間，或則V和G之間的其它氨基酸（除了N、V、G三個(gè)氨基酸外）。這個(gè)特征區(qū)作為我們識(shí)別IRI的主要依據(jù)[38,39]，而圖4.2中顯示了我們所獲得的IRI基因之間的重復(fù)IRI區(qū)(NxVxxG)和(NxVxG)，它們都位于整個(gè)基因長(zhǎng)度中間偏后區(qū)域，而且這些區(qū)域的重復(fù)不是直接的串聯(lián)式的重復(fù)，而是在這些重復(fù)區(qū)間內(nèi)插入了別的氨基酸。對(duì)于重復(fù)IRI區(qū)(NxVxxG)和(NxVxG)，鄧順陽(yáng)等[40]在對(duì)黑麥草抗凍蛋白基因的研究中提到對(duì)IRI基因進(jìn)行序列分析時(shí)，預(yù)測(cè)其有兩個(gè)冰晶結(jié)合面a面和b面，每面的模體“xxNxVxG”可能與親水性有關(guān)，都以額氨酸(V)為冰晶結(jié)合中心。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與大部分抗凍蛋白一樣，含有類似的β-螺旋結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可能與冰晶結(jié)合的表面和抑制重結(jié)晶有關(guān)[41]。

本研究所獲得的IRI基因除了具有IRI特有的特征區(qū)NxVxG/NxVxxG之外，還有其它共有的特征區(qū)域信號(hào)肽、偶數(shù)個(gè)半胱氨酸C（除B25外因?yàn)閴A基突變導(dǎo)致有三個(gè)C外，其余已獲得的基因均有4個(gè)半胱氨酸C）、亮氨酸重復(fù)去LLR，這些共有的特征區(qū)

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小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定以及純化

為一般功能基因所共有，但不同功能的基因其結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)部序列不同。測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的W15和B24編碼的氨基酸序列和其它6個(gè)基因相似性很低，導(dǎo)致后續(xù)基因編碼錯(cuò)亂，可能直接影響這兩個(gè)IRI基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)，推測(cè)可能影響重結(jié)晶抑制蛋白的冰結(jié)晶抑制效應(yīng)等相關(guān)效應(yīng)。

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致謝

本研究論文在郭志富老師悉心指導(dǎo)下完成。導(dǎo)師在設(shè)計(jì)的選題試驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究?jī)?nèi)容方面都給我以嚴(yán)格的要求和關(guān)鍵性的指導(dǎo)，設(shè)計(jì)完成后給以詳細(xì)的審閱和修改。導(dǎo)師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、勤奮忘我的工作精神、扎實(shí)深厚的專業(yè)知識(shí)及熱情真摯的修養(yǎng)品行深深地感染著我，他言傳身教使我在學(xué)術(shù)思想、工作作風(fēng)、為人處世等諸多方面都終生受益。值此論文答辯之際，特向我的恩師致以崇高的敬意和衷心的感謝。此外，還有生物技術(shù)教研室140室給我指導(dǎo)與教誨的鐘鳴、李浩戈、陳麗靜、馬慧、林景衛(wèi)老師，郭老師課題組的白麗萍老師、農(nóng)學(xué)院的衣瑩老師，以及幫我修改英文文章的馮玉龍?jiān)洪L(zhǎng)，從法國(guó)歸來的安迎鋒老師，向老師們表示我最誠(chéng)摯的謝意。

實(shí)驗(yàn)過程中我還要感謝那些幫助過我或者我?guī)椭�過的師兄師姐，學(xué)弟學(xué)妹，因?yàn)橛心銈儙椭�，我能在一年�?nèi)把研究生階段能做的實(shí)驗(yàn)快速學(xué)會(huì)，因?yàn)槲夷転閷?shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃慊驅(qū)W弟學(xué)妹們提供實(shí)驗(yàn)幫助，我的實(shí)驗(yàn)技能得以更加?jì)故�。謝謝去年研三的黃國(guó)濤、齊欣、單存海、楊鋒師兄、馬爽、趙莉師姐；謝謝今年研三的閆文文、殷宇、陳啄、鐘聲、劉彥飛、曹珊、李麗麗、孫春遇、葛菱、劉曉宇、金迪；謝謝10級(jí)研究生姜躍，在我201*年6月時(shí)第一次進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室做實(shí)驗(yàn)，還有10級(jí)研究生張亞琳、彭丹、李麗麗、祝紅艷、劉新建、王麗、殷曉娟；當(dāng)然不能忘了07級(jí)本科生杜慧、李同同、黨曉璇，還有馬超、馬明南、孟思紋我們這些緊緊圍繞在郭老師周圍的親們；和我一樣08級(jí)的陳萍、嚴(yán)菊、王碩、劉暢、袁，09級(jí)學(xué)妹王靜宜。因?yàn)槟銈�，我在�?shí)驗(yàn)室得以專業(yè)知識(shí)、實(shí)驗(yàn)技能快速提升，能參加各種生物學(xué)相關(guān)的學(xué)術(shù)講座和生物公司的技能培訓(xùn)講座，能發(fā)表英文文章，能去北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)習(xí)，能在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)做了自己大學(xué)階段最有意義的事。因?yàn)槟銈儯�我的大學(xué)生活、實(shí)驗(yàn)室生活過得豐富多彩，過得充實(shí)，因?yàn)槟銈儯�我在生物找回了自己的興趣。感謝所有關(guān)心、幫助過我的同學(xué)們、朋友們!愿他們學(xué)業(yè)有成，工作順利，家庭幸福！

最后我還要感謝培養(yǎng)我長(zhǎng)大含辛茹苦的父母，養(yǎng)育之恩，無以回報(bào)，你們永遠(yuǎn)健康快樂是我最大的心愿。

在此論文完成、即將離開校園之際，謹(jǐn)向所有關(guān)心、支持、幫助我的各位老師、同學(xué)表示最誠(chéng)摯的感謝!

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沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)承諾書

設(shè)計(jì)題目完成人姓名小麥近緣屬種IRI基因的分離、鑒定及進(jìn)化分析張富專業(yè)生物技術(shù)指導(dǎo)教師姓名郭志富職稱講師本畢業(yè)設(shè)計(jì)的創(chuàng)新點(diǎn)：1.本研究以小麥野生近緣屬種為研究材料，對(duì)植物中的IRI抗凍基因進(jìn)行分離。以材料的特殊性狀為切入點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)的功能研究。2.本研究獲得的8個(gè)IRI基因與已知相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其均為新的變異類型，在抗凍功能上可能有不同表現(xiàn)，為更好的理解不同IRI基因分分子間的抗凍分子機(jī)制提供了新的參考。承諾內(nèi)容：本畢業(yè)設(shè)計(jì)是本人在導(dǎo)師郭志富老師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，沒有抄襲他人成果，對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明，完成人簽名：指導(dǎo)教師簽名：年月日年月日

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