1儀器與材料
高效液相色譜儀,P680A,美國戴安;UV-1100紫外分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器有限公司;751G分光光度計(jì),上海分析儀器廠;電子天平,0.0001g/0.00001g,XR205SM-DR,瑞士普利賽斯。滲漉筒,500ml,自制。
防己,購于成都市荷花池藥材市場,產(chǎn)地:浙江,含粉防己堿1.13%;粉防己堿對照品,含量測定用,批號0711-20005,中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;乙醇,醫(yī)用,95%,購于宜賓?邓帢I(yè)瀘州分公司;其余試劑均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1方案設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,滲漉工藝的主要影響因素為乙醇濃度、浸泡時(shí)間、乙醇倍數(shù)、滲漉速度等,故選定以上4個(gè)考察因素,每個(gè)因素設(shè)三水平,以防己總堿、粉防己堿的提取率為評價(jià)指標(biāo)(權(quán)重系數(shù)均為0.5),按L9(34)正交表實(shí)驗(yàn),表頭設(shè)計(jì)見表1。表1因素水平(略)
稱取防己粗粉100.0g,加入1倍量相應(yīng)濃度的乙醇,攪拌均勻,密閉放置2h,待藥粉充分膨脹和潤濕后,裝筒,按《中國藥典》2005年版滲漉法[1]實(shí)驗(yàn),加入相應(yīng)濃度的乙醇,浸泡12~48h,開始滲漉,流速1~5ml·min-1·kg-1,收集相應(yīng)量的滲漉液,并用相同濃度的乙醇定容到1000ml,得樣品液(含生藥0.1g/ml)。
2.2總生物堿的含量測定
2.2.1貯備液的制備精密稱取5mg粉防己堿對照品,至10ml容量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,搖勻(0.496mg/ml)。
2.2.2最大吸收波長的選擇精密稱取粉防己堿對照品1mg,置25ml量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,精密吸取0.2ml,置10ml量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,搖勻。采用紫外分光光度法,在波長200~400nm處進(jìn)行掃描,結(jié)果見圖1。粉防己堿的最大吸收波長為282nm。
2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密量取貯備液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml,置10ml容量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,搖勻。以乙醇為空白,在282nm處測定吸收度,根據(jù)測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并求得回歸方程:A=12.949309C-0.063,相關(guān)系數(shù)r=0.99998。
2.2.4樣品的測定分別精密量取樣品溶液5ml,置100ml燒杯中,水浴蒸干,殘?jiān)踊旌先軇ㄒ颐眩郝确拢阂掖迹?0%氨水,25∶8∶2.5∶1)40ml,攪拌后浸泡10min,超聲處理10min,放置片刻,傾濾,殘?jiān)没旌先軇┫礈?次,5ml/次,濾液水浴蒸干,殘?jiān)靡掖既芙獠⒍ㄈ葜?5ml,精密量取上述溶液1ml,置10ml容量瓶中,加乙醇至刻度,搖勻,以乙醇作空白,于282nm處測定吸收度,計(jì)算總生物堿含量。結(jié)果見表2。
2.3粉防己堿含量測定
2.3.1色譜條件色譜柱為DikmaKromasilC18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶0.06%二乙胺溶液(60∶20∶20),檢測波長282nm,流速1.0ml/min,進(jìn)樣量10μl。
2.3.2對照品溶液的制備精密稱取粉防己堿對照品10mg,置10ml棕色量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻(1mg/ml)。
2.3.3供試品溶液的制備精密量取樣品液10ml,置50ml蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,殘?jiān),用流?dòng)相溶解,轉(zhuǎn)入25ml量瓶,加流動(dòng)相至刻度,搖勻,離心,取上清液,0.22μm濾膜過濾。
2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定取上述對照品溶液用流動(dòng)相稀釋,制備成每毫升含0.05,0.10,0.25,0.50,0.75,1.00mg粉防己堿的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述色譜條件分別進(jìn)樣5μl,以粉防己堿的峰面積A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo)作圖,求得粉防己堿的回歸方程為:A=63.8738C-0.3118,r=0.9998,粉防己堿濃度在0.05~1.0mg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。
2.3.5測定分別精密吸取對照品溶液(0.25mg/ml)與供試品溶液各10μl,注入液相色譜儀,測定,按外標(biāo)法計(jì)算含量,即得。液相色譜圖見圖2~3,測定結(jié)果見表2,方差分析見表3。表2防己滲漉正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果(略)表3方差分析(略)
直觀分析及方差分析表明,乙醇濃度對防己的滲漉工藝有極顯著影響,故選擇最佳濃度A1,而B,C,D因素對工藝的影響較小,從方便生產(chǎn)、節(jié)約成本的角度,選擇浸泡24h,(B2),收集6倍量滲漉液(C1),滲漉速度為快速(D3)。即A1B2C1D3。據(jù)此條件,驗(yàn)證3批。結(jié)果見表4。表4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(略)
3討論
在方法學(xué)研究中,參照文獻(xiàn)資料我們考察了∶甲醇-水(40∶60),甲醇-水-二乙胺(82∶18∶0.2),甲醇-水(83∶17,含0.5g/L的三乙胺),甲醇-乙腈-水-二乙胺(65∶25∶10∶0.08),甲醇-乙腈-0.003moL/LKH2PO4-二乙胺(55∶25∶20∶0.06)等多種流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果表明本文方法分離度好,分離效能高。流動(dòng)相中加入少量二乙胺,能較好地改善分離度,并使峰形更好。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,優(yōu)選工藝收得率與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近,但優(yōu)選工藝節(jié)約了乙醇,減少了時(shí)間,降低了生產(chǎn)成本,粉防己堿的提取率達(dá)到了83%,說明本工藝合理可行,適用于大生產(chǎn)。
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,隨著防己總堿提取率的增高,粉防己生物堿的提取率也相應(yīng)增高,說明兩者的含量之間有一定對應(yīng)關(guān)系。
防己總堿的檢測參照文獻(xiàn)方法[3],采用了混合溶劑。可以有效地避免雜質(zhì)干擾。
【參考文獻(xiàn)】
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【摘要】目的研究防己滲漉提取的最佳工藝。方法以防己總堿和粉防己堿為考察指標(biāo),采用正交實(shí)驗(yàn)法對防己的滲漉工藝進(jìn)行研究。結(jié)果確定了最佳工藝條件為浸漬24h,60%乙醇6倍量滲漉,滲漉速度為快速。結(jié)論工藝合理可行,可應(yīng)用于生產(chǎn)。
【關(guān)鍵詞】防己滲漉正交實(shí)驗(yàn)總生物堿粉防己堿
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